摘要
独脚金内酯(Strigolactones, SLs)是一种抑制植物分枝的新型植物激素，SLs的合成和信号传导途径目前还不完全清楚，尤其是信号途径更是知之甚少。
本研究以多个水稻矮化多分蘖突变体包括 SLs 合成途径中的丛矮2号、S1-40、gsor23 和信号途径中的 gsor300079、gsor300097 为实验材料，通过图位克隆的方法找到到上述突变体中发生突变的基因。
采用酵母双杂交等方法筛选出了与 SLs 信号途径中 D3 和 D14 相互作用的蛋白，同时利用 EMS 诱变获得了多个 d14 的表型恢复突变体，为进一步揭示 SLs 调控水稻分蘖和植物分枝的作用机制奠定了基础。
一级学科
植物学
二级学科
植物分子生物学
简述
方案包含四大部分：
1、独脚金内酯合成途径 OsCCD7 的克隆与表达分析。
2、独脚金内酯合成途径 OsCCD8 的克隆与表达分析
3、独脚金内酯信号途径 D3 基因的功能分析。
4、独脚金内酯信号途径新基因的筛选与功能验证。
核心设备
荧光定量 PCR 仪、PCR 仪、凝胶成像系统、激光共聚焦显微镜
关键词
独脚金内酯，图位克隆，酵母双杂交，蛋白互作
实验流程及设备
相关科研团队
从事此研究方向比较强的科研团队
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基本概念
水稻杂交系，图为克隆，基因定位，基因克隆，转基因技术
实验流程
1、独脚金内酯合成途径 OsCCD7 的克隆与表达分析
水稻分蘖是决定粮食产量最重要的农艺性状之一，也是决定株型结构的重要因素。
水稻分蘖又是一种特殊的产穗分枝，研究控制水稻分蘖的分子遗传机理具有重要的理论意义和应用价值。
1.1 水稻材料与农艺性状
籼稻品种丛矮2号(cl2)、93-11和 Dular，粳稻品种日本晴和 IC-2-1 由山东省水稻研究所提供，籼稻 Indica9 由本实验室保存。矮化多分蘖突变体S1-40是由日本晴经1% 甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate, EMS)诱变而来。
分别播种9311、cl2、日本晴和 S1-40，成熟期统计株高、分蘖数目、节间长度、穗型及籽粒大小等主要农艺性状。
1.2 遗传群体的构建
用丛矮2号与粳稻品种 IC-2-1、S1-40 与籼稻品种 Dular 分别杂交并自交获得 F2 群体，于抽穗期调查 F2 群体中正常株与矮化多分蘖株的分离情况，统计正常株与突变株的分离比例并进行卡平方测验。
以 F2 代中矮化多分蘖个体组成定位群体，采用 CTAB 法提取水稻基因组 DNA。
1.3 突变基因的初步定位
基因初步定位时，首先根据混合群体分离分析法(Bulked-segregant analysis, BSA)的原理(Michelmore et al., 1991),，利用本实验室保存的均匀分布在水稻12条染色体上的170对InDel (Insertion and deletion)标记引物进行多态性筛选并找出可能连锁的标记，再用F2代单株验证该多态性标记是否真正与目标基因连锁。
基因精细定位时，根据已公布的水稻全基因组序列信息(http://rgp.dna.affrc.go.jp/E/toppage.html)，水稻基因组注释项目(http://rice.plantbiology.msu.edu/)以及BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对粳稻品种日本晴和籼稻品种93-11的基因组序列，寻找 InDel 位点，然后利用 Premier Premier 5.0 软件在 InDel 两侧设计特异引物，开发新的InDel标记，引物英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
PCR 扩增产物经8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经0.1% AgNO3 染色后判断F2个体的基因型。
1.4 目的基因的回收
目的基因片段的回收选用超薄琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒。
1.5 独脚金内酯处理
采用 Umehara 方法并稍加改动：水稻种子先在70%酒精消毒30 s，再在2.5%的次氯酸钠灭菌5 min，灭菌水冲洗3~5次，28℃暗培养2天，萌发的种子转移至 Kamachi 水稻营养液，并用纱布支撑。
独脚金内酯人工合成类似物 GR24，用丙酮或甲醇溶解，配制成10 mmol L-1的母液。实验分为对照组和实验组，分别加入0和1 µmol L-1 GR24， 每组4株幼苗，设三次重复，16 h光照/8 h黑暗，每3天换一次营养液，处理3周和4周后分别统计分蘖数。
1.6 实时定量 RT-PCR
Real-time PCR 实验采用宝生物工程(大连)有限公司试剂盒，在 Applied Biosystems 公司的7900HT Real-Time PCR 仪上进行。以水稻 ubiquitin 基因作为内参，水稻 ubiquitin 及独脚金内酯相关基因。
Real-tmie PCR 程序: 首先预变性95℃ 30 s；其次95℃ 5 s 变性，60℃ 30 s退火/延伸，40个循环，溶解曲线阶段95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，每个反应做三次生物学重复。
2、独脚金内酯合成途径 OsCCD8 的克隆与表达分析
水稻分蘖是决定粮食产量最重要的农艺性状之一，研究水稻分蘖对提高作物产量以及以水稻作为模式植物来研究植物分枝具有重要的实际与理论意义。
2.1 遗传群体的构建
以 gsor23和粳稻品种02428杂交构建F2分离群体，在山东济宁种植 Indica9、gsor23、F1 和 F2 群体，于抽穗期调查F2群体中正常株与矮化多分蘖株的分离比例并进行卡平方测验。
2.2 基因定位及候选基因的测序
以 F2 代中矮化多分蘖个体组成定位群体，采用CTAB 法分别提取每个单株的基因组 DNA。
gsor23 初步定位根据混合分离分析法(BSA)的原理，从F2群体中随机选取突变株10株 DNA 等量混合做突变个体混池，同时两亲本 DNA 等量混合作为亲本混池，利用本实验室保存的均匀分布在水稻12条染色体上的170个 InDel (插入缺失)标记，进行多态性筛选，再利用多态性标记进行 gsor23 的初步定位分析。
2.3 独脚金内酯处理及实时定量PCR
Real-time PCR 实验采用宝生物工程(大连)有限公司试剂盒，在 Applied Biosystems 公司的 7900HT Real-Time PCR 仪上进行。以水稻 ubiquitin 基因作为内参，水稻 ubiquitin及独脚金内酯相关基因。
3 独脚金内酯信号途径D3基因的功能分析
3.1 植物材料及杂交群体的构建
水稻矮化多分蘖突变体 gsor300097 和野生型粳稻品种 Akumuro 以及其他粳稻品种 Shiokari，矮化多分蘖突变体 d10-1由 Rice Genetic Stock Center (GSOR)，USDA-ARS Dale Bumpers National Rice Research Center馈赠。
粳稻品种日本晴和广陆矮4号由山东省水稻研究所袁守江提供。于山东济宁构建 gsor300097，广陆矮4号杂交群体。
3.2 gsor300097 突变位点的确定
由于 gsor300097 的矮化多分蘖表型与独脚金内酯缺陷型突变体相像，我们选用实验室保存的已经发表过的与独脚金内酯相关基因最近的连锁标记：D3 连锁引物 C6-2，D10 连锁引物 C1-WT4，D14 连锁引物 M4，D27 连锁引物 C11-8，D17 连锁引物 C4-CL5 (上述引物序列见附表1)，对32株矮化多分蘖突变体F2单株进行基因型分析。
3.3 独脚金内酯的处理和实时定量 RT-PCR 分析
Real-time PCR 实验采用宝生物工程(大连)有限公司试剂盒，在 Applied Biosystems 公司的 7900HT Real-Time PCR 仪上进行。以水稻 ubiquitin 基因作为内参，水稻 ubiquitin及独脚金内酯相关基因。
3.4 D3-GFP 载体的构建及亚细胞定位
为了研究D3蛋白的亚细胞定位，D3被克隆到 1205CGFP 载体的 XbaI，EcoRI 位点，产生 CaMV35S 驱动的 1205D3CGFP 载体。采用基因枪轰击的方法转化洋葱表皮细胞。
4、独脚金内酯信号途径新基因的筛选与功能验证
独脚金内酯(SLs)信号途径中的 D14 蛋白生化功能目前还不清楚，有可能做为 SLs 的受体，也有可能做为水解酶对SLs进一步修饰从而产生有生物活性的激素。
为揭示 D14 蛋白的生化功能，首先要明确 D14 蛋白在亚细胞水平的定位情况，再将这些互作蛋白的编码基因在水稻体内敲除或者过量表达，观察转基因植株的分蘖表型是否发生改变，这些互作蛋白质将为揭示D14的生化功能提供有利的线索；
4.1 D14-GFP 载体的构建及亚细胞定位
D14 编码α/β-fold hydrolase superfamily，基因组全长1048 bp，有1个91 bp的内含子。
为了研究D14蛋白的亚细胞定位，将无终止密码子的 D14 全长 CDS 连接在绿色荧光蛋白 GFP 的 N 端(XbaI，EcoRI位点)，产生 CaMV35S 驱动的 p1205D14CGFP 融合蛋白植物表达载体，采用基因枪轰击的方法转化洋葱表皮细胞。
4.2 荧光双分子互补(BiFC)载体的构建
将 NAC1 构建 pSPYNE(R)173-NAC1 与 pSPYCE(M)-D14 (SalI)，全长 cDNAs 采用PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 进行扩增。pSPYNE(R)173 (YNE) 与 pSPYCE(M) (YCE)。
采用 In-Fusion 重组法 (Clontech)，所有引物接头都含有SalI，PCR 产物回收与 YNE，YCE (SalI单酶切)回收产物进行重组。
首先要转化至大肠杆菌感受态中，步骤与常规质粒转化一样，最后将阳性克隆测序正确。
4.3 D14 蛋白的原核表达及纯化
D14 全长 CDS (双酶切位点为 NdeI、BamHI)可由构建好的 pGBKT7-D14 (NdeI、BamHI) 亚克隆进原核表达载体 pMAL-C5X (NdeI、BamHI) 采用双切双连的方法构建pMAL-C5X-D14 原核表达载体，具体操作步骤同一般载体构建。
将测序鉴定正确的阳性克隆质粒 DNA 转化 Escherichia coli K12 TB1 感受态。
4.4 d14 表型恢复突变体的筛选
采用1%甲基磺酸乙酯(EMS)诱变 d14 突变体，筛选 d14 突变体的表型恢复突变体，M1 代按单株收种子，M2 代分株系种植，从中筛选分蘖表型恢复正常的 d14 的表型恢复突变体。
未来再采用图位克隆的方式分离表型恢复突变体的基因，并研究这些基因在独脚金内酯信号传导途径中的功能。
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