摘要
近乎通用的标准遗传密码是所有现存生命具有共同祖先的最有力证据之一。然而，新的代表不同密码子重新分配组合的遗传密码变体一直在被发现，并且发现的频率相当稳定。近来，许多人工设计的密码被构建出来，用于指导非天然氨基酸的掺入，从而实现生物防护和病毒抗性。然而，演化生物学家和合成生物学家似乎常常不了解对方领域的发展。在此，我们试图弥合这一隔阂，并提供一份更新的概述，涵盖在生物体及其细胞器中自然报道的不同密码子重新分配和遗传密码变体（目前均已超过50例）。我们回顾了已极大扩展的、偏离标准遗传密码的案例，重点介绍了先前未预料到的密码形式及其分子基础。为了解释密码子含义及相关背景的情况（例如过去十年在原生生物中发现的、没有专用终止密码子的变体），我们引入了密码子同形异义的概念。考虑到对遗传密码多样性存在普遍性的这种新认识，我们也重新审视了遗传密码在演化中如何以及为何会发生改变的问题。最后，我们总结了人工重新设计遗传密码的现状，这些设计正日益偏离自然的密码改变，开辟了全新的翻译可能性。
引言
遗传密码对于理解生物学的重要性，如同元素周期表对于理解化学一样。在化学中，已知有94种天然存在的元素，而在一个多世纪里，人类已制造出25种元素。对于遗传密码而言，情况则大不相同：一个版本，即规范或标准遗传密码，占主导地位，然而已发现超过50种天然替代变体（尽管大多数很罕见）（表S1），并且尽管相关数据集呈指数级增长，其发现速率却趋于平稳。然而，替代性人造遗传密码的数量正在迅速增长。据推测，一些新的、自然存在的替代遗传密码仍有待发现，但它们将被数量庞大的人工版本所淹没。事实上，合成生物学使我们能够产生几乎无限的遗传密码变异组合，以实现不同的目标，例如为病毒感染设置屏障、防止转基因生物发生不必要的水平基因转移，以及掺入非标准氨基酸。
遗传密码是细胞用于将mRNA编码的信息翻译成蛋白质氨基酸序列的一套规则。标准遗传密码的完全阐明属于20世纪的关键发现之一。现在，编码序列在翻译过程中被解读为一串非重叠的核苷酸三联体（称为密码子），每个密码子要么指定20种常见蛋白质源性氨基酸之一，要么充当翻译终止信号（UAA、UAG、UGA），这些信号由释放因子而非tRNA识别，这已成为教科书知识。四种不同的核苷酸提供了64种可能的密码子，使得标准遗传密码必然是简并的，大多数氨基酸由多个（二至六个）同义密码子指定（图1）。当然，由遗传密码指导的翻译仅指基因解码过程的单个环节。其他方面，包括通过顺式和/或反式剪接、RNA编辑以及3'端加工和聚腺苷酸化进行的转录本加工，都能在编码区被翻译解读之前对其产生影响。值得注意的是，翻译起始（即起始密码子的选择）也受独立于严格意义上的遗传密码的规则所支配。在细菌和真核生物中，偶尔会使用“标准”AUG以外的密码子来启动翻译。在这种情况下，相同的起始tRNA解码不同的起始密码子，忽略了在延伸阶段起作用的密码子-tRNA配对的“正常”规则。
图1 标准遗传密码表
显示了标准的64个三联体。其中，已知在生命之树任何地方发生过自然重分配的19个三联体组合以彩色标示，反映了它们被发现的位置。注意，细菌中UAG的重分配目前仅限于其作为Pyl（吡咯赖氨酸）的多义解码与标准翻译终止并行；详见正文。为简洁起见，同形异义的UGA解码为Sec（硒代半胱氨酸）（我们认为这是标准遗传密码的一部分，见框1）未在图中标示。
标准遗传密码的分子实现机制已被深入理解，因为它具有近乎普遍性、直接的逻辑和机制上的优雅：携带特定氨基酸的tRNA具有与正确密码子组通过碱基配对结合的反密码子。特定tRNA所携带氨基酸的身份主要由专用的氨酰-tRNA合成酶（下文简称合成酶）定义，这些合成酶将一个或几个tRNA与特定氨基酸连接起来，尽管在某些情况下存在替代途径（框1）。tRNA反密码子与mRNA密码子之间的相互作用通常通过第三位密码子/第一位反密码子的碱基摆动配对得以扩展，这使得一个tRNA能够识别并结合多个编码相同氨基酸的（同义）密码子。因此，给定翻译系统所使用的不同tRNA的数量通常远少于密码子的数量，但往往并非接近理论最小值，因为存在所谓的同工受体tRNA，它们携带相同的氨基酸，但与不同的密码子配对。在真核生物中，我们通常发现约45种同工受体tRNA。不同tRNA基因的拷贝数也各不相同，原核生物中以单一tRNA物种的基因为主，而在真核生物中，拷贝数随着基因组大小的增加而稳步增加。丰富的碱基修饰进一步影响密码子-反密码子配对的特异性，要么扩展要么限制所允许的可能组合。核苷酸序列的翻译由核糖体和一系列翻译因子完成，按照mRNA指定的顺序连接氨基酸。携带氨基酸的tRNA依次与核糖体A位点的单个密码子匹配，随后在其P位点形成肽键，脱酰化的tRNA通过E位点退出。翻译的终止由释放因子介导，它们结合终止密码子，随后将完整的多肽从与前一个密码子配对的tRNA上释放出来。
框1
标准遗传密码与忒修斯悖论
标准遗传密码的通常定义是，它是如图1所示的最广泛分布的遗传密码变体。然而，这种表示忽略了普遍存在的UGA同形异义现象，即该密码子依赖背景被替代性地解码为Sec（硒代半胱氨酸）。允许通过UGA重编码利用硒代半胱氨酸的组分的保守性和广泛的系统发育分布，证明了其在最后共同祖先（LUCA）时期就已存在。因此，我们认为依赖SECIS元件–SelB的UGA解码构成了标准遗传密码的一部分。从这个角度看，次生丢失了这一特征的生物体（和细胞器）则表现出非标准的遗传密码变体。但是，UAG作为（多义的）终止和吡咯赖氨酸（Pyl）密码子又如何呢？这里情况更为复杂。这种现象仅出现在一些古菌和细菌谱系中，并且似乎很容易用较晚的起源及随后的水平基因转移介导的传播来解释，如果不是因为Pyl-tRNA合成酶与其他氨酰-tRNA合成酶一样古老的系统发育证据。也许Pyl掺入机制及依赖它的基因存在于LUCA的祖先中，在一些后代谱系中幸存下来，但并未存在于LUCA本身。这样的“姊妹”谱系随后可能在灭绝前将Pyl机制贡献给了LUCA的一些后代。根据这种假设性情景，Pyl编码是古老的，但并不属于标准遗传密码的一部分。
但标准遗传密码概念存在更深层次的问题：尽管密码子含义总体上保持不变，但自LUCA以来，其基础组分和机制一直在持续演化。细菌中的释放因子与古菌和真核生物中的释放因子非同源，尽管它们具有大致相似的结构（模拟tRNA形状）并共享一个参与将完整多肽链从最终tRNA上释放的保守基序。在真核生物和古菌中，使用单一的释放因子，而反直觉的是，细菌和细胞器使用两个无关的释放因子。这两种替代机制中哪一种是祖先机制尚不清楚；甚至有人推测LUCA利用了一种类似tRNA的RNA终止子，后来被蛋白质性质的释放因子独立取代。
产生相同氨酰-tRNA物种的机制也可能不同。对于谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸，它们各自的氨酰-tRNA可以通过两种方式合成：要么由专用的合成酶直接合成，要么间接地通过将前体氨基酸（分别是谷氨酸、天冬氨酸和磷酸丝氨酸）连接到tRNA上，然后由专用酶对氨酰部分进行修饰¹⁹⁶,¹⁹⁷。在真核生物的细胞质翻译中，这三种氨酰-tRNA的生产通过直接途径进行，而原核生物和细胞器在部署直接和间接途径方面则各不相同，这表明其涉及水平基因转移和替换的复杂演化史。专门负责生产Gln-tRNA的合成酶（GlnRS）似乎是真核生物的创新，后来被引入到几个细菌谱系中，包括γ-变形菌门，取代了祖先的间接机制。认识到大肠杆菌（原型细菌）的翻译依赖于一个由真核生物发明的组件，这是非常引人注目的！即使在比较直接合成氨酰-tRNA的途径时，也存在替代方案。例如，有两种无关的合成酶形式专门负责赖氨酰-tRNA（LysRS）的合成，它们分别在两大氨酰-tRNA合成酶组（I类和II类）中独立演化。II类LysRS在生命之中占主导地位，而I类LysRS仅零星出现在各种细菌和古菌谱系中。
还存在各种各样的tRNA修饰，这些改变对于tRNA的折叠、稳定性、氨酰化以及解码功能本身都至关重要。一个很好的例证是对于正确解码AUA为异亮氨酸至关重要的不同修饰（具体来说，是那些允许区分AUA与编码甲硫氨酸的AUG的修饰）。在细菌、其衍生的细胞器以及古菌中，用于此任务的tRNAIle与解码另外两个异亮氨酸密码子（AUU, AUC）的tRNA不同。反密码子第一位（摆动位）特定的胞苷衍生物（细菌和细胞器中的赖苷，古菌中的鲱精胺）允许与密码子第三位的A配对，但不与G配对。然而，细菌中存在例外，例如寄生菌Mycoplasma mobile，它缺乏常规的tRNAIleCAU及其修饰酶，而是拥有一个独特的tRNAIleUAU，其反密码子未经修饰，可以读取AUA，同时通过其核糖体以某种方式避免了该tRNA对AUG的解码。在真核生物的翻译中，AUA的解码主要依赖于一个在反密码子第一位带有肌苷（由腺苷脱氨产生）的tRNA，该tRNA也解码AUU和AUC。此外，还存在第二个具有ΨAΨ反密码子（Ψ表示通过尿苷酶促转化引入的假尿苷）的tRNA，专门解码AUA。在现存生命之树中AUA解码方式的多样性可能表明，该密码子并未被LUCA使用，只是在后来的细菌和古菌干群中被异亮氨酸独立捕获。真核生物AUA解码机制为何及如何演化，仍然是一个悬而未决的问题。
除了这些在标准遗传密码实现上的主要差异之外，在整个生命之树中还存在着翻译装置组分猖獗（尽管不那么显眼）的更新换代。例如，tRNA被功能等效但完全无关的新tRNA所取代，包括最初具有不同反密码子和氨基酸特异性的tRNA（异源受体tRNA）发生突变后的复制品，这一过程被称为“tRNA基因招募”或“tRNA重塑”。大多数线粒体基因组丢失了许多（有时是全部）tRNA基因，而从胞质溶胶中输入所缺失的tRNA源自真核生物（即，它们并非原始线粒体基因易位到核基因组的结果）。水平基因转移一直是氨酰-tRNA合成酶演化的主要驱动力，导致了普遍的同源异位基因置换，其供体包括与受体系统发育距离各不相同的细胞生物以及病毒。某些绿藻在其线粒体中利用UGA终止密码子，尽管缺乏相应的线粒体释放因子（mtRF2a），有人提出蓝藻来源的质体同源物（pRF2）的双重靶向是确保在这些情况下正确解码UGA的一种机制。总而言之，标准遗传密码的概念让我们想起了神话中的忒修斯之船：更换了所有的木板之后，它还是原来的那艘船吗？
如上所述的遗传密码运作过程，与生物学中的通常情况一样，是对真实事态的理想化。使情况复杂化的是固有的分子噪声（反映了分子相互作用的随机性），它限制了解码的保真度。因此，以一定的频率，非预期的氨基酸会被引入新生多肽链、翻译会提前终止、和/或终止密码子会发生通读。此类翻译错误的发生频率（误译率）可能会波动，例如在应激或疾病期间，但在不同生物体之间也有所不同。例如，合成酶通常具有编辑结构域，能选择性移除非关联的氨酰-腺苷酸（转移前编辑）或从tRNA上移除非关联的氨基酸（转移后编辑）。然而，某些内共生或寄生细菌及真核生物表现出编辑结构域的退化，导致tRNA错误负载和误译增加（框2）。自然发生的人类tRNA基因变异也能导致误译。由此类误译所增加的蛋白质组多样性是否具有适应性，或者一般而言，它是否仅仅反映了选择在施加更高翻译保真度方面的局限性，目前尚存争议。
框2
术语表
模糊解码（Ambiguous decoding）—在文献中，该术语常被不加批判地用于指代所有特定密码子在显著高于翻译可靠性内在限制的水平上，被翻译成两种或多种不同结果的情况。然而，其潜在机制和结果分布可能完全不同；也就是说，“模糊”这个术语本身被模糊地用于指代不可比较的现象。我们在下文区分了密码子多义性和密码子同形异义性。
正交性（Orthogonality）—这个概念最初指tRNA能够专一地与其对应的合成酶相互作用，同时避免与给定生物体中存在的其他类型的tRNAs和合成酶发生交叉反应的状态。在扩展遗传密码时，必须保持这种状态。随着人工编码的爆炸性发展，它现在用于描述在翻译过程中仅限于相互识别的分子组件组（合成酶、tRNAs、mRNAs和核糖体），从而避免或最小化与内源翻译机器的交叉反应。更广泛地说，在合成生物学中，例如在活细胞中引入人工非经典氨基酸时，它用于指最小化与宿主机器的任何类型的非预期相互作用。
密码子同形异义性（Codon homonymy）—我们引入这个术语，指代这样的情况：一个密码子可以具有多种含义，而给定的翻译系统根据该密码子出现的特定背景来区分这些含义。UGA作为终止密码子（默认）或作为硒代半胱氨酸密码子（在具有SECIS结构的mRNAs中）是密码子同形异义性的经典例子。而在包括各种纤毛虫或锥虫Blastocrithidia在内的多种原生生物谱系中，某些密码子被系统性（即全基因组范围）地用作有义密码子（当在阅读框内时）或终止密码子（当位于编码序列的3'末端时），则是这种现象更惊人的体现。
密码子多义性（Codon polysemy）—这指代这样的情况：一个密码子具有多种含义，并且其翻译结果似乎取决于偶然性。这并不意味着系统总会以50:50的比例分布，而是指单个密码子的结果没有偏向性。该术语于1997年首次创造，尽管真实的例子直到后来才被发现，例如在酵母Ascoidea asiatica中。
密码子重分配（Codon reassignment）—当某个密码子的所有实例在原则上都在一个细胞或细胞器中获得了新的含义时，适用此术语。可以识别三类：终止密码子到有义密码子、有义密码子到有义密码子，以及有义密码子到终止密码子的重分配。被系统性用作核糖体移码信号的密码子，例如纤毛虫Euplotes属（广义）阅读框内的UAA和UAG密码子，可能被概念化为代表其自身的一个密码子重分配类别。
错误负载（Mischarging） — 该术语指生产负载了与根据该生物体遗传密码本应关联的氨基酸残基不同的tRNA。值得注意的是，其内涵（“错误负载”导致“错误”氨基酸的掺入）掩盖了许多情况下该机制实际上是适当反应的一部分。一种有趣的可能性是：活性氧（ROS）介导的细胞损伤可能触发非Met-tRNA发生显著的保护性甲硫氨酸错误酰化，导致甲硫氨酸掺入普遍增加，从而缓冲氧化损伤。
重编码（Recoding） — 这指代某些三联体被翻译的方式不同于给定翻译系统所使用的遗传密码所规定的含义的情况。从机制上讲，重编码依赖于该三联体在转录本中的上下文与翻译系统组件之间的相互作用，以及外部的调控因子，例如特定代谢物的可用性。给定位置的密码子可能默认被重编码翻译（例如，位于SECIS元件上游的UGA密码子），或者其翻译可能在标准和重编码方式之间变化，这取决于特定的生理线索。
另一类使上述简单逻辑复杂化的不规则现象，包括以系统发育上广泛存在的共翻译掺入硒代半胱氨酸（Sec）为例的现象。该机制依赖于对默认密码子含义（通常是UGA终止密码子）的局部重新定义，这取决于mRNA中的特定二级结构（SECIS元件）以及控制将tRNASec插入核糖体A位点的特定翻译延伸因子。包括程序性核糖体移码、翻译跳跃、或由特定分子信号介导的受调控终止密码子通读在内的过程，是mRNA特定区域（通常是一个密码子）的解读偏离该生物体遗传密码标准规则的进一步例子。在这里，特定的因子或信号影响了翻译过程。这类现象可以方便地归在“重编码”这一总称下。然而，我们承认这个术语的使用更为灵活，经常指代概念上不同的情况，即特定密码子系统性（也就是说，在给定物种或分类支系的所有基因中）偏离标准含义。这种变化更恰当地称为密码子“重分配”，它们是区分不同遗传密码变体的特征，并将在下文中详细讨论。
在开始这个话题之前，我们认为有必要对用于描述密码子解读不同模式的现有词汇进行进一步的澄清和扩展（关键术语词汇表另见框2）。某些重编码和重分配案例常被描述为“模糊解码”，但正如在他处所述，该术语含义模糊，并在不同上下文中描述非常不同的现象。在一种情景下，某个特定密码子被系统性地以两种（或假设更多）并行方式解读，不论基因如何以及该密码子在编码序列中的位置如何。曾有人提议用“多义密码子”一词来形容这种配置，并且随着近期符合真正密码子多义性的报道出现，我们提议应重新启用该术语。另一种情况是，密码子根据其背景具有不同的含义，如前所述的UGA在某些mRNAs的特定位置被解码为Sec就是例子。我们提议在此类情况下使用“同形异义密码子”这一术语。因此，标准遗传密码包含许多同义密码子（不同密码子具有相同含义）以及同形异义的UGA密码子（框1）。其他引人注目的、谱系特异性的密码子同形异义性案例将在后面讨论。
遗传密码具有演化可塑性
标准遗传密码如何起源是生物学中最棘手的问题之一，目前尚无普遍接受的假说。标准遗传密码曾被称为"冻结的偶然事件"，并因其重要性而被认为难以改变。然而，在超过10种替代方案的庞大规模中，标准遗传密码是非随机的且高度优化的（优化水平取决于所考虑的参数，例如错误稳健性），尽管并非绝对最佳。无论如何，其组成似乎对点突变的影响具有高度抵抗力，因为突变的密码子通常是同义的或者指定了具有相似生化特性的氨基酸。关键的是，标准遗传密码本身也会发生变化。因此，将其描述为"冻结但偶尔融化"更能反映现实：它可以在特定情况下演化，显示出与细胞生存相容的微小改变。因此，遗传密码的运作在现存生命的多样性中存在着显著差异，并且至少可以识别出这种变异的两个不同轴。
较不显眼的轴反映了导致相同结果（相同密码子含义）的不同分子解决方案的情况，这体现在不同翻译系统在分子水平上实现标准遗传密码的多种不同方式。这些差异涉及特定氨酰-tRNA合成的细节、密码子特异性所需的tRNA特定修饰，或者释放因子的数量和性质。对于其中许多差异，分界线存在于细菌（及其线粒体和质体衍生物）与古菌/真核生物之间，这表明了其深层的演化起源，并引发了关于最后共同祖先（LUCA）采用了哪些解决方案（如果有的话）对比那些是原始机制的替代品的问题。例如，细菌和细胞器中的翻译终止依赖于两种不同（但同源）的释放因子RF1和RF2，分别识别UAG/UAA和UAA/UGA，而古菌和真核生物则利用一个单一的、无关的全能释放因子aRF1/eRF1来识别所有三个终止密码子。所有这些变异都隐藏在一个未改变的、标准遗传密码的表象之下（框1）。
遗传密码变异的另一个轴涉及不同密码子如何被解读：即密码子指定的特定氨基酸（或终止信号）。自其发现以来，遗传密码因其在生物体产生的每一个蛋白质的生产中的核心作用，一直被视为极难改变。这种对进一步演化的制动被描述为"蛋白质组约束"。随着人类线粒体基因组测序的完成，遗传密码通用性的概念崩塌了。通过证明UGA被读作色氨酸而非终止信号，AUA被解码为甲硫氨酸而非异亮氨酸，以及AGA/AGG（通常指定精氨酸）作为终止密码子发挥作用，对人类线粒体基因组的分析展示了所有三种主要的密码子重分配类型：终止密码子到有义密码子、有义密码子到有义密码子，以及有义密码子到终止密码子。
随后迅速出现了在其他线粒体、细菌、真核生物核基因组和病毒中密码子重分配的进一步报道，后来又在质体中发现了首个非规范遗传密码的实例（表S1和S2）。在新千年开始之前，已经发现了丰富的替代遗传密码景观及其负责的分子机制。尽管此后发现新遗传密码变体的速度有所放缓，但在过去十年中，主要由于对分类学上日益多样化的基因组和转录组数据进行系统筛选，发现速度再次上升。基于详尽的文献调查，我们编制了一份已知密码子重分配、其组合及分类学分布的最新列表（图2-4及表S1和S2）。我们注意到，NCBI提供的遗传密码（或翻译表）列表 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/index.cgi?chapter=cgencodes) 并非权威资源（尽管常被如此认为），因为它仅覆盖了约一半已知的遗传密码变体，其中一些定义不准确（表S1）。因此，GenBank（以及各种二级序列数据库）中维护的许多蛋白质序列，特别是线粒体的序列，与实际情况不符。另一个问题是：大多数报道的密码子重分配案例仅代表基于比较序列分析的生物信息学推断，应谨慎对待。
图2 密码子重分配在生命所有域、细胞器和病毒中的分布
所有有充分文献记载的案例均以受影响的密码子或相关密码子组的形式显示，后跟标准遗传密码中的氨基酸单字母代码（括号内）以及重分配后的氨基酸。IUPAC碱基代码：N = A+C+G+U；R = A+G；W = A+U。字母O表示Pyl；星号 (∗) 表示终止密码子；缩写 f.s. 代表移码信号；斜杠符号 (/) 在密码子同形异义或多义的情况下分隔密码子的两种替代含义。为简洁起见，省略了UGA作为Sec密码子的同形异义含义，以及帕金虫属（Perkinsus）线粒体中作为移码信号的多个密码子（见正文）。图标示意性地描绘了检测到重分配的各类生物群（详见图例说明）；重分配不一定存在于给定群的所有成员中。密码子重分配分类学分布的参考文献见表S1和S2。另见"结论与展望"部分，了解近期报道但未能纳入图中的密码子重分配案例。
图3 细菌的系统发育树及已知密码子重分配的分布
为简化起见，系统发育树以主要谱系从单一节点出发的未解析多歧分支形式呈现，除非有证据表明同一属中的不同物种可能使用不同的遗传密码变体，否则不提供种加词。将不同的密码子重分配案例（圆圈数字）映射到树上，以最简约地解释它们在现存类群中的出现；有关重分配的详细信息见树图例。UAG多义性（同时作为Pyl和终止密码子）的案例未在图中显示。在暂定种Providencia siddallii中，所示的终止到色氨酸的UGA重分配仅涉及一个特定菌株（PSAC），并且该密码子似乎仍用于终止少数基因的翻译（所知甚少，无法将这种模糊性归类为密码子同形异义或多义性）。所示密码子重分配的参考文献见表S1和S2。
图4 真核生物的系统发育树及已知密码子重分配的分布
仅显示了影响核基因组的重分配（由圆圈数字标示），并将其映射到反映当前共识的简化系统发育树上，以最简约地解释它们在现存类群中的出现；一些未报道密码子重分配的较小真核生物谱系已从图中省略。对于纤毛虫，列出了不同的重分配组合而未提供其系统发育背景，仅指示了报道发现它们的特定纤毛虫类群（分号分隔的类群代表独立的重分配）。同时标示了密码子同形异义性（用星号表示）和多义性（用星形符号表示）的案例；f.s. 对应移码信号。更多细节见图形图例和正文。所示密码子重分配的参考文献见表S1和S2。最近的一项研究暗示，纤毛虫中存在比图中所示更广泛的、推定为UAG、UAA或UGA同形异义解码（有义/终止密码子）的重分配组合，但需要进一步研究来验证这些结果。
迄今为止描述的自然演化的密码子重分布在密码图表（图1）上的分布是不均匀的，一些密码子能够有多种替代解读（目前的记录保持者是UAG，有九种可能的氨基酸结果，包括吡咯赖氨酸）（表S2），而许多其他密码子，例如GGN，（到目前为止）仅指定规范氨基酸（甘氨酸）（图1）。然而，这种情况可能存在偏差，因为当使用默认的标准遗传密码进行概念性翻译时，终止密码子的重分配由于相应编码区的中断而更容易被识别。确实，最近对原核生物基因组的有针对性计算筛选发现了多例有义到有义的重分配，并且比较DNA序列与质谱数据很可能会发现更多的密码改变。根据目前的知识，特定遗传密码变体中重分配密码子的数量从1到6个不等，这种高数量在不同真核生物谱系的线粒体中多次实现（表S1）。在古菌中，迄今为止已知的唯一偏离标准遗传密码的情况涉及UAG解码为吡咯赖氨酸（下文将更详细讨论）。
显然，任何导致密码子重分配的、偏离标准遗传密码的情况都必须有翻译系统中特定变化作为基础。这些变化几乎总是涉及获得和丢失的组合——无论是整个组件还是其特定功能（图5、图6和框3）。因此受影响的组件包括tRNAs（在所有重分配类型中）和释放因子（在终止到有义或有义到终止的重分配中）。合成酶变化的作用和范围研究严重不足：尽管理论上预期它们是大多数密码子重分配的关键部分，但仅有很少与特定重分配相关的特定合成酶变化的充分记录实例。有时，支撑密码子重分配的特定tRNA变化并非源于tRNA基因本身的突变，而是依赖于介导转录后编辑或tRNA修饰的酶机制的变化。据我们所知，直接导致自然发生的密码子重分配的核糖体或延伸因子的特定变化尚未被描述。
图5 支撑已知终止到有义或有义到终止密码子重分配的释放因子变化。
三种不同的释放因子，细菌RF1和RF2（以及它们各自的细胞器对应物，mRF1a/pRF1和mRF2a/pRF2）以及真核生物eRF1，通过名称和颜色进行标识。在某些绿藻（许多Scenedesminia，包括其亚组Scenedesmaceae）线粒体中零星发现的UGA密码子可能被双重靶向的pRF2识别（虚线轮廓），但缺乏直接证据。不同的星形颜色表示导致每个释放因子下方标示的密码子结合能力丧失（黄色高亮）或获得（青蓝色高亮）的（组合）突变（见正文）。在脊椎动物线粒体中，一个谱系特异的RF1旁系同源物（标有星号）具有特异性改变的密码子结合结构域，介导AGR密码子处的翻译终止。
图6 在tRNA水平上介导密码子重分配的分子变化类型
注意，tRNAs的绘制方式显示反密码子为3'到5'方向，而密码子则标示为5'到3'方向。（A–C）在不同生物体或翻译系统中介导UGA解码为色氨酸的三种替代性tRNA改变，包括反密码子突变（A；例如，在人类线粒体中）、基于胞苷脱氨的反密码子编辑（B；在锥虫类线粒体中），以及反密码子茎中松动顶部碱基对的突变（C；例如，在锥虫类Blastocrithidia属的细胞质翻译中）。注意，终止到有义密码子的重分配也需要释放因子的改变（图5）。（D）tRNA中的突变可能改变其携带的氨基酸，从而介导有义到有义的重分配；此处以细菌芽孢杆菌纲一个未培养谱系中报道的案例为例。（E）有义到有义的氨基酸重分配由影响两个tRNAs的变化介导，一个tRNA的密码子特异性受到限制（顶部），另一个则被拓宽（在某些无脊椎动物线粒体中；底部）。涉及核苷酸修饰（两个tRNA）和反密码子突变（其中一个tRNA）的变化；'Q'表示修饰的G核苷酸奎奥斯苷。其他IUPAC碱基代码：H = A+C+U；Y = C+U；N = A+C+G+U（另见图2）。（F–H）涉及丢失原始关联tRNA并结合新出现的解码机制的有义到有义密码子重分配示例。在后两种情况下，具有新功能的tRNAs代表了图中所示原始tRNA的重复拷贝。（F）在一些线粒体和质体中发生的Ile到Met的AUA重分配依赖于对现有tRNAMet的改变，例如，通过对其反密码子第一位进行甲酰化，如图所示。（G）在酵母目Alaninales中，CUG被一个由标准tRNAAla通过反密码子突变演化而来的tRNA解码为丙氨酸。（H）CUN密码子盒被一个通过tRNAHis变形演化而来的不寻常tRNA解码为苏氨酸（在酿酒酵母及其近亲的线粒体中）。
框3
密码子重分配背后的分子变化
理解导致密码子重分配的演化步骤的总体框架考虑了影响翻译机器的两种演化变化——丢失和获得——以不同的事件顺序组合发生。下面，我们展示已针对特定密码子重分配阐明的实例。在此背景下，翻译系统组件的丢失将包括该组件被完全重新用于新功能的情况。
影响释放因子的变化（图5）。 这里，丢失型事件包括完全丢失一个释放因子（这仅在具有功能部分重叠的RF1和RF2的细菌和细胞器翻译系统中可能发生），或者发生改变释放因子密码子结合区域的突变，从而降低它们对特定终止密码子的亲和力。预计这些变化是终止到有义重分配的基础，并且事实上，细菌（RF2）和细胞器释放因子（RF1或RF2）的完全丢失，以及可能限制其密码子特异性的eRF1突变，已被广泛记录。后者的一个显著例子是eRF1的Ser70突变，这与锥虫亚目中终止到色氨酸的UGA重分配相关。限制密码子识别特异性的候选突变也在线粒体释放因子中被报道。在绿藻谱系Scenedesminia的两个支系的线粒体中，UAG被独立地重分配为有义密码子（对应亮氨酸或丙氨酸），但在这种情况下，由于先前发生了mtRF2a的丢失，mtRF1a不能被丢失。相反，在这两个支系的mtRF1a中都观察到了一个在高度保守的密码子结合位点上发生的特异性平行突变，推测这降低了该蛋白对UAG的亲和力。在盘蜷纲原生生物中，mtRF2a密码子结合区域的另一个独特突变可能削弱了与重分配给酪氨酸的UAA的相互作用。最后，作为合成生物学项目的一部分，在大肠杆菌中对细菌RF2的突变形式进行了工程改造，以降低其与UGA的结合。影响释放因子的获得型变化是有义到终止重分配所必需的，目前仅在某些线粒体中已知（但见结论与展望部分）。这里，新释放因子的出现已得到充分证实（识别AGR密码子的脊椎动物特异性mtRF1旁系同源物），并且分别在Scenedesminia的mtRF1a和盘蜷纲的mtRF2a中鉴定到了扩展所识别密码子组的候选"功能获得"突变，以解释非标准终止密码子（前者为UCR，后者为UUA和AGR）的使用。然而，任何提出的线粒体释放因子突变在密码子识别变化中的作用都有待实验证实。
影响tRNAs的变化（图6）。 与释放因子类似，tRNAs可能丢失，或者突变可能阻止先前关联密码子的翻译，导致与有义到终止和有义到有义重分配相关的丢失型变化，这两者都有先例。例如，在某些无脊椎动物中，解码AAA/AAG为赖氨酸的标准线粒体tRNALys的反密码子突变为CUU，这（连同新获得的修饰）使其仅关联AAG，而AAA被重分配，由一个在修饰上发生变化的tRNAAsn解码为天冬酰胺，该修饰扩展了其密码子结合特异性，超出了AAY（图6E）。然而，真正的tRNA丢失在密码子重分配中似乎更为常见。正文中提到了细胞器中Ile到Met重分配的一个明显例子：AUA密码子特异性tRNAIle的反复丢失，连同丢失一种使其通过将反密码子第一位的胞嘧啶转化为赖苷而关联AUA而非AUG的酶（称为TilS）。tRNA丢失自然也与有义到终止重分配相关，例如Scenedesminia线粒体中tRNASerUGA的丢失，其相应的UCR密码子现在作为翻译终止信号。与影响tRNAs的丢失型变化相对应，获得型变化可能包括新型tRNAs的出现（通过基因复制和分化而非从头产生）或tRNA获得与特定密码子配对的能力。终止到色氨酸的UGA重分配提供了具有这种效果的不同获得型tRNA变化的例子。这些包括将经典tRNATrpCCA的反密码子突变为UCA，将其解码能力从UGG扩展到UGA，以及通过改造一个最初解码非色氨酸密码子并携带不同氨基酸的重复异源受体tRNA而出现tRNATrpUCA。在锥虫类线粒体中，UGA解码为色氨酸依赖于一种细胞器靶向的胞苷脱氨酶的出现，该酶编辑同样从胞质溶胶输入的标准tRNATrpCCA的反密码子为UCA。如上所述，最近在Blastocrithidia和Condylostoma中描述了另一种tRNA变化，作为其核基因中UGA解码机制的一部分。这里，由于突变，形成tRNATrpCCA反密码子茎的标准五个核苷酸对的顶部变得松散（"解钉"），显著提高了该tRNA作为UGA解码器的效率。值得注意的是，相同的tRNATrpCCA改变似乎已被其他在其核基因组中独立将UGA重分配给Trp的真核生物所采用（纤毛虫Blepharisma和Loxodes，以及一种Amoebophrya sp.）。由于密码子-反密码子配对高度受转录后tRNA修饰的影响，获得新的修饰也可能参与密码子重分配。上述无脊椎动物线粒体中解码AAA的tRNAAsn就是这样一个案例。另一个例子由前述线粒体中Ile到Met的AUA重分配提供：尽管确实存在通过非标准关联tRNAMetUAU进行解码的情况（在尾索动物或双壳类中），但更常见的机制依赖于延伸子tRNAMetCAU，它通常仅解码AUG。然而，其密码子特异性可以通过修饰来扩展，这些修饰在不同分类群间有所不同。在后鞭毛生物中，这些修饰包括反密码子第一位的5-甲酰胞苷，或者未修饰的第一位与紧接反密码子下游的N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷的组合。在非后鞭毛生物类群的线粒体或质体中AUA解码如何运作仍有待确定。原则上，有义到有义的密码子重分配可能源于对现有（未复制的）tRNA的直接突变，使其成为不同合成酶的底物（而不改变反密码子）。这种途径似乎很罕见，但最近报道了一个令人信服的例子：在一个未培养的细菌谱系中，tRNAMetCCU从tRNAArgCCU演化而来，解释了其Arg到Met的AGG重分配。
影响氨酰-tRNA合成酶的变化。 与释放因子和tRNAs中变化的作用相比，关于合成酶在密码子重分配中作用的了解甚少。一些合成酶不依赖反密码子序列作为tRNA的身份元件，因此原则上不需要改变其结构来让它们有效地携带与指定其他氨基酸的密码子配对的tRNAs。这似乎是SerRS或AlaRS的情况，解释了在展示不同CUG重分配的酵母中，CUG（通常编码亮氨酸）如何能被新的关联tRNAs解码为丝氨酸或丙氨酸。在其他情况下，如果合成酶要携带具有非标准反密码子的tRNAs，则预期其识别反密码子的区域会发生突变。例如，在许多已将UAR（或仅UAG）重分配给谷氨酰胺的真核生物中，胞质GlnRS就是这种情况，但据我们所知，这些尚未成为专门研究的对象。一个罕见的例外是在一个酵母支系（包括酿酒酵母）中发生的线粒体ThrRS，该支系展示了CUN密码子盒从亮氨酸到苏氨酸的重分配。这些酵母拥有一个解码CUN的tRNA，它代表了一个经典tRNAHis的高度突变重复副本，由与解码标准ACN苏氨酸密码子盒的传统tRNAThrUGU相同的ThrRS携带。实验证据表明，随着这种新型tRNA的出现，线粒体ThrRS获得了拓宽其底物特异性的突变。同样值得注意的是在某些细菌中发现了新的正交tRNA/合成酶对（由标准对的突变旁系同源物组成），它们介导某些非脯氨酸密码子"故意误译"为脯氨酸或将UGA解码为半胱氨酸而非其标准解码为硒代半胱氨酸。所有上述影响合成酶的变化都属于获得型，而我们尚未意识到任何丢失型变化（除了那些与"平凡的"功能等效合成酶替换相关的变化）。
遗传密码动物园
详细讨论所有已知的密码子重分配及其潜在分子机制超出了本综述的范围，因此读者可参阅其他综述以及表S1和S2中列出的原始报告。相反，我们重点介绍那些最实质性地改变了我们对遗传密码演化多样化范围认知的较新发现。
有义到有义密码子重分配范围的扩大
有义到有义密码子重分配长期被认为几乎只限于线粒体，例外的是白色念珠菌及相关酵母核基因中CUG的Leu到Ser重分配。然而，后来某些藻类的质体也加入了此类，因为它们表现出AUA的Ile到Met重分配。这种在线粒体和质体多个谱系中的平行转换，是普遍影响细胞器的简化演化的明显体现，在后一种情况下涉及一个独特的tRNAIle及其参与修饰其反密码子以使其关联AUA的专用酶的丢失（详见框3）。在质体中发现的有义到有义重分配或许不如最近使用专用计算机工具Codetta对原核生物基因组进行系统筛选的结果令人惊讶。该筛选首次揭示了自由生活细菌谱系中的有义到有义密码子重分配，特别是一些精氨酸密码子重分配给甲硫氨酸、色氨酸或谷氨酰胺。有趣的是，这组重分配与在线粒体中发现的丰富种类完全没有重叠（表S2），表明不同的演化约束塑造了细菌及其细胞器后代的遗传密码演化。最后，酵母中CUG密码子的故事结果比先前设想的要复杂得多（详见下文）。
重新审视密码子多义性
一些研究表明，念珠菌及相关酵母中的CUG是被模糊解码的，其新演化出的关联tRNASerCAG经历了相当程度的被亮氨酸错误负载。有人提出了CUG作为多义密码子（框2）的概念，并推测由此产生的蛋白质组异质性赋予了选择优势。然而，尽管最初的发现支持CUG大量替代性解码为亮氨酸，但后来方法学上更先进的分析表明，CUG解码的"模糊性"处于核糖体误译的背景水平。尽管这个提出的CUG多义性被有效证伪，但在另一个独立酵母谱系的一个成员中发现了不同的、引人注目的案例。在Ascoidea asiatica中，CUG被两个不同的竞争性关联tRNA随机解码，一个携带亮氨酸，另一个携带丝氨酸，导致在相应位置上两种氨基酸几乎等量出现。由不同tRNA竞争相同密码子导致的潜在密码子多义性曾被认为存在于某些线虫中，但未被后来的蛋白质组学工作所证实⁷，使得A. asiatica中的情况目前是独一无二的。然而，在一些链霉菌科中存在另一个密码子多义性案例的有力候选者。这些细菌拥有一个独特tRNA家族（tRNAProX）的成员，其携带的反密码子与标准丙氨酸（GCU）、苏氨酸（ACU）或天冬酰胺（AAU）密码子之一关联，但却被携带脯氨酸，这是由传统脯氨酰-tRNA合成酶的一个不寻常旁系同源物介导的。尽管在不同tRNAProX将关联密码子误译为脯氨酸的能力已在大肠杆菌中得到证明，但它们在这些链霉菌科自身中的功能尚未被直接研究。因此，尚不清楚它们是否、在何种程度上、以及在何种条件下可能导致GCU、ACU或AAU的多义性，以及这种现象的生物学意义可能是什么。
细胞器释放因子的功能与演化可塑性
在半自主细胞器中发现的大量密码子重分配，在很大程度上依赖于对翻译终止的修补（图5）。线粒体和质体从其细菌祖先那里继承了两个识别终止密码子的同源释放因子，分别称为mtRF1a/pRF1（识别UAG/UAA）和mtRF2a/pRF2（识别UAA/UGA）。已知细菌RF2或其细胞器对应物的丢失与UGA重分配为有义密码子相关。近来，有报道称丢失了RF1的线粒体和质体利用UAG（在一种情况下也包括UAA）作为有义密码子。这表明细菌型翻译系统在没有RF1的情况下运作并无障碍，这增加了最终在自由生活细菌中发现UAG被重分配为有义密码子的可能性。事实上，这已在大肠杆菌中人工实现。另一个近期的更新是，在来自两个不同原生生物谱系的线粒体释放因子mtRF1a和mtRF2a中，首次发现了候选的功能丧失和功能获得突变；这些变化被假设为分别限制或拓宽了密码子识别特异性，从而允许在这些原生生物中观察到的特定终止到有义或有义到终止密码子的重分配。使用非标准终止密码子（AGA和AGG）的不同实例已在脊椎动物线粒体中演化出来。早期曾提出几种机制，但近来，脊椎动物特异性的mtRF1a旁系同源物（令人困惑地被称为mtRF1）被可靠地证明在这些密码子处介导翻译终止。
真核生物中UAA和UAG的含义可能解耦
在2017年之前，已有报道称在各种原生生物谱系（主要是纤毛虫）的核基因组中，UAG和UAA发生了许多终止到有义的重分配（对应Gln、Glu或Tyr）。在所有这些代表至少13次独立遗传密码转换的案例中，这两个密码子的含义始终保持耦合，仿佛存在一种功能约束将它们的命运联系在一起。然而，尽管在原生生物核基因组中继续报道到UAG/UAA耦合重分配的其他案例，但现在已知至少有七个不同的原生生物谱系在其核基因组中表现出UAG作为有义密码子（编码Gln、Leu或Ser），同时专门保留UAA作为终止密码子（图2、图4和表S1）。这表明eRF1可以被修饰，使其保留识别UAA的能力，同时降低其对UAG的亲和力。UAG和UAA之间的功能性区分也在锥虫类Blastocrithidia属或纤毛虫Peritromus kahli中发挥作用。在这里，UAA是同形异义的，保留其翻译终止功能的同时分别编码Glu或Gln，而UAG则完全重分配给相同的氨基酸。最后，最近在一个未培养的纤毛虫中记录到UAG和UAA编码两种不同的氨基酸（分别是Glu和Lys）。
病毒对宿主遗传密码的操纵
已有描述使用UAG作为有义密码子（通常对应Gln）的噬菌体，并且出乎意料地高比例地发现于肠道微生物组中。引人注目的是，尚未有来自细菌的UAG重分配报道。此外，不仅从感染具有相应重分配的细菌宿主的噬菌体中报道了UGA作为有义密码子，也从感染具有标准遗传密码的宿主的噬菌体中报道了这种情况。因此，这些噬菌体，以及那些以UAG为有义密码子的噬菌体，必须调整其宿主的遗传密码才能使其蛋白质被正确翻译。为此，它们经常编码与重分配的终止密码子对应的"抑制型"tRNAs、相应的氨酰-tRNA合成酶、和/或识别另外两个（未重分配的）终止密码子的释放因子。重分配的密码子通常局限于在噬菌体感染晚期表达的基因，即仅在噬菌体重新编程其宿主之后才表达。如果任何此类噬菌体在早期表达基因中使用UAG或UGA作为真正的终止密码子（此时终止密码子识别仍仅由宿主原生翻译系统控制），这将意味着存在一种独特的密码子同形异义案例，其中密码子的含义在两类基因之间变化。
没有专用终止密码子的遗传密码
几个无关的原生生物谱系的核基因组以一种真正出乎意料的方式偏离了标准遗传密码：它们缺乏专用的终止密码子。最初在某些纤毛虫和Blastocrithidia中独立发现，类似的密码变体随后在其他纤毛虫谱系以及寄生性甲藻阿米巴藻属（Amoebophrya）中被发现。在所有情况下，一个、两个或所有三个常见的终止密码子都表现出同形异义性，当出现在阅读框内时指定一个氨基酸，当位于编码区末端时充当终止信号。至少在其中的一些案例中，这类同形异义密码子在真正的终止密码子之前的序列中是匮乏的，强调沿着mRNA的位置定义了决定此类密码子替代性解读的上下文。这种形式的密码子同形异义在分子水平上是如何实现的，基本上仍未得到研究。一种可能的解释假设eRF1（与其调节因子真核释放因子3，eRF3形成复合物）与聚(A)结合蛋白之间存在特定的相互作用。这种相互作用可以将eRF1拴在真正的终止密码子附近的编码序列末端，同时阻碍其与上游框内终止密码子的相互作用。最近建立的Blastocrithidia nonstop作为遗传上易操作的模型，为对这个问题的实验研究开辟了新的可能性。最近报道了一种来自放射虫类原生生物线粒体的、缺乏专用终止密码子的密码变体，其中UAG和UGA被完全重分配，而UAA具有有义/终止双重含义。我们注意到，在保留一个或两个标准终止密码子的密码变体中，也观察到了具有有义/终止双重含义的密码子，例如在某些纤毛虫的核基因组、一种绿藻的质体以及一种昆虫的细菌内共生体中就是这种情况。这些案例是代表密码子同形异义，还是翻译机器（尤其是在细胞器和内共生体例子中）读取双重含义密码子的方式更类似于密码子多义性，仍有待确定。
吡咯赖氨酸的特殊案例
共翻译插入吡咯赖氨酸（Pyl）作为第22种氨基酸的发现，标志着遗传密码概念最引人注目的扩展之一。然而，尽管经过二十多年的研究，关于Pyl利用的演化和机制实现的重要问题仍然悬而未决。其在古菌和细菌域中零散的分布，与关于Pyl利用是何时演化以及其现存系统发育分布是如何建立的多种对比性演化场景相兼容（更多细节见框1）。在机制方面，Pyl由UAG密码子编码，其方式似乎与UGA编码Sec类似。然而，曾假设存在类似于SECIS的顺式作用决定子，允许翻译系统区分指定Pyl的UAG实例与那些本应作为翻译终止的实例，但未能得到证实。相反，Pyl编码似乎更可能源于关联tRNAPylCUA与相应释放因子（古菌中的aRF1，细菌中的RF1）的竞争。这种解读最近得到了实验证据的支持，证据表明在一个利用Pyl的模式古菌中，UAG是被"模糊地"解码的（在一定比例的翻译事件中作为Pyl或翻译终止）。因此，根据本文倡导的术语，Pyl的编码（至少在其被详细研究过的生物体中）代表了一个密码子多义性的案例，这与终止/Sec的UGA同形异义性不同。多义的UAG解码很可能与适应度成本相关，这些成本似乎以不同的方式得以缓解。据报道，利用Pyl的细菌使用UAG作为常见的终止密码子，但其中至少有一些细菌仅在含有Pyl的酶的特定底物存在时，才表达将其解码为Pyl的机制。在一些利用Pyl的古菌中也报道了类似的机制。此外，这些生物体中UAG作为终止密码子的使用率往往较低。最近报道了古菌使用所有UAG密码子编码Pyl的极端案例；这些古菌因此表现出成熟的密码子重分配。
具有三重含义的密码子
早期阐明的UGA解码为Sec，随后发现的UAG以背景依赖方式编码Pyl，以及最后上述描述的位置特异性终止密码子重分配案例，都提供了充分的证据，表明一个密码子在同一个翻译系统的上下文中，既可以发出翻译终止信号，也可以编码一个氨基酸。一个同形异义密码子可以编码两个不同的氨基酸，这一点最初在纤毛虫游仆虫（Euplotes）中得到证实，其中UGA指定半胱氨酸（Cys），但也支持使用常见的SECIS依赖途径插入Sec。有趣的是，各种细菌谱系已经从UGA切换到支持Sec插入的其他密码子（仍然使用相同的一般机制），包括UAG和UAA，以及几个编码氨基酸的密码子。尽管这些密码子在这些细菌中保留了它们的标准含义，但它们额外变成了具有终止/Sec或有义/Sec配置的同形异义密码子。引人注目的是，UGA作为Sec密码子也至少在上述提及的一些真核生物中得以保留，在这些真核生物中，该密码子承担另外两种上下文依赖的角色：发出翻译终止信号和编码色氨酸。因此，UGA在这些生物体中变成了三重同形异义。一个具有三重含义的密码子的不同案例来自各种细菌，它们拥有一个与Sec特异性tRNA相似、但却携带（或预测携带）半胱氨酸的tRNA，同时还拥有标准的tRNASec。其中一些tRNA以SECIS依赖的方式解码UGA的能力已在大肠杆菌中得到证明，这表明它们允许相应的细菌在活性位点选择性地生产带有硒代半胱氨酸或半胱氨酸的硒蛋白，这可能依赖于环境线索。这将意味着UGA同时具有同形异义性（以转录本上下文依赖的方式表现为终止/有义）和多义性（在相同的特定位置表现为Sec/Cys）。
具有非三联体特征的自然遗传密码
标准遗传密码的一个绝对核心特征是其三联体性质：编码以单一阅读框中连续系列的非重叠三联体密码子形式进行。然而，即使是这个方面也可以通过一种称为"程序性核糖体移码"的重编码类型进行调整，尽管很少见。引人注目的是，核糖体移码在纤毛虫游仆虫属（Euplotes）中已变得系统化（即全基因组范围），该属的核基因经常包含框内的UAG或UAA三联体，这些三联体非但不终止翻译，反而发出+1或+2移码信号，具体取决于前面的密码子。因此，这种遗传密码具有固有的非三联体特征，并且显然正在通过中性演化在基因组中扩展。事实上，这种非规范遗传密码也缺乏专门用于翻译终止的密码子（见上文），因为UGA被完全重分配以编码Cys，而UAG和UAA仅在编码序列的最末端才作为终止密码子起作用。在Perkinsus（一类寄生性肺泡藻）的线粒体中也报道了类似的情况。所有三种线粒体编码蛋白质的合成都需要在对应于特定密码子的位置发生+1或+2核糖体移码事件（每个基因1到10次），这些密码子在Perkinsus线粒体基因组中未被使用，因此构成了专用的移码信号。
遗传密码在演化中如何以及为何发生改变
在自然界中观察到的密码子含义改变实例，源于一系列演化步骤，其确切顺序和驱动力量在不同案例中各不相同。然而，并非总能获得特定线索来进行精确的历史重建。尽管如此，关于导致密码子重分配的可能演化路径的理论推理，以及那些似乎代表了中间阶段的案例的存在，已经催生了几种替代性的、不一定相互排斥的假说，这些假说可能适用于大多数现实生活中的实例。
第一个解释密码子重分配的明确假说——"密码子捕获"，其构思是为了最小化演化谱系的适应度负担。现在被称为"密码子消失"，它假设密码子首先从基因组中消失（例如，由于长期的突变偏好和/或基因组精简），随后是其解码机制（即涉及的tRNAs和/或释放因子）的丢失或突变。接着，一个新演化出的解码机制在密码子重新出现时赋予其新的含义。密码子的完全消失并非不现实，例如多种真核生物细胞器基因组中完全不存在UGA。UGA消失的最常见原因是细胞器（及其他内共生体）基因组GC含量降低的普遍趋势，导致UGA被UAA取代。有趣的是，一些没有UGA的原生生物线粒体仍然保留了关联的mtRF2a，尽管理论上mtRF1a在这里足以终止翻译。在其他案例中，例如在大多数绿藻的线粒体中，UGA和mtRF2a都缺失了（这可能反映了它们在绿藻门共同祖先中的丢失）。这使得这些基因组为变化做好了准备：在一些绿藻谱系中，UGA重新作为终止密码子出现（由双重靶向的pRF2或可能是一个修饰过的mtRF1a解码），或者随着关联tRNA的出现而变成了色氨酸密码子。后一种结果可能源于最初导致UGA消失的同样的AT偏好突变压力，以标准色氨酸密码子UGG为代价重新引入了该密码子。尽管降低GC含量或许是终止到色氨酸的UGA重分配最常见的首要原因，但一个基因组极小但GC含量却很高的α-变形菌昆虫内共生体（Candidatus Hodgkinia）（图3）提供了一个显著的反例。一个类似的演化轨迹可能导致（出于某些原因更为罕见的）UAG密码子的终止到色氨酸重分配，一个极端富含AT的非光合寄生植物质体基因组 spectacularly 例证了这一点。
另一个密码子重分配假说设想了一个模糊的中间阶段，其中密码子可以被原始的和新演化出的解码器交替解码。上面提到了一个引人注目的例子：酵母A. asiatica，其CUG被关联tRNALeuCAG和tRNASerCAG随机解码。tRNA共存可能是Ascoideales目的祖先状态，但大多数后代（与A. asiatica不同）此后完全丢失了tRNALeuCAG，或保留了功能未知的突变形式。模糊中间阶段的说法曾被用来解释ulvophytes核基因组中UAA/UAG（UAR）终止到谷氨酰胺重分配的非单系分布，假设在一个系统发育上嵌套的、表现出标准UAR含义的谱系中发生了向标准遗传密码状态的逆转。然而，ulvophytes系统发育关系的完善以及在一个先前未表征的ulvophytes谱系（Scotinosphaera中UAG的终止到丝氨酸重分配）中发现不同的遗传密码变化，支持了在ulvophytes演化过程中发生了多次完全独立的遗传密码变化（图4）。
与模糊中间阶段相对的是未分配密码子假说。一个密码子的原始解码器（tRNA或释放因子）丢失或发生突变，导致其被次优解码，例如被近关联tRNA解码，直到最终出现一种替代的解码机制。尽管未分配密码子模型所要求的缺失解码器已在特定案例中被报道，但这类例子常常具有误导性。一个恰当的例子是：脊椎动物线粒体中的AGA和AGG密码子。关联tRNAs缺失，这些密码子仅出现在某些线粒体ORF的末端。最初认为，当这些密码子出现在A位点时，核糖体会发生停滞并经历-1移码，从而能够通过标准机制终止，但如前所述，最终发现mtRF1是AGA/AGG特异性的释放因子，在遇到这些密码子时终止翻译。tRNA反密码子以外区域发生的、对密码子结合具有未预期影响的改变（例如Blastocrithidia、某些纤毛虫和一种Amoebophrya sp.中的tRNATrpCCA）（框3），或者不易在计算机模拟中预测的转录后tRNA改变（通过编辑和/或核苷酸修饰），可能参与了解码其他一些看似未分配的密码子。需要进一步研究这些密码子的真实状态，以及可能的替代解码机制。
2016年，有人提出了一个tRNA丢失驱动假说，其中"一个tRNA或一个释放因子发生突变或丢失，以至于其关联密码子的解码受到严重干扰甚至废除"，根据作者的说法，这将解释大多数已知的重分配。本质上，这代表了十年前提出的未分配密码子模型的一种体现。该假说最初被用来解释酵母中的密码子重分配，假定其按如下方式演化：首先，在一个包括酿酒酵母在内的广泛酵母支系的共同祖先中，发生了tRNALeuCAG的单次丢失（换句话说，即类似于未分配密码子的状态）；接着，在不同的后代中独立出现了CUG解码tRNA，当这些tRNA携带亮氨酸时，保留了标准遗传密码（如酿酒酵母），但当它们携带丝氨酸或丙氨酸时，则导致了终止到亮氨酸或终止到丙氨酸的CUG重分配。然而，详细的序列分析支持至少发生了七次独立的祖先tRNALeuCAG基因丢失，伴随着替代性CUG解码器的出现，并且至少有一个谱系，即前述的Ascoideales目，遵循的是模糊中间阶段假说而非未分配密码子假说。
根据先前的讨论，可以清楚地看到，构建理解偏离标准遗传密码的一般概念框架，与重建导致其现实案例发生的情境和事件顺序是两件不同的事情。最令人信服的是对各种线粒体密码子重分配的历史重建，尽管通常我们无法完全确定遵循了上述哪个模型。特别是，我们可能永远无法知道密码子是从基因组中完全消失了（密码子消失模型），还是在影响其解码的丢失或获得事件发生时，它虽然极其罕见但仍然被使用。进一步说明这些困难的是，在Blastocrithidia或Condylostoma中观察到的那种位置特异性密码子解码（密码子同形异义性），是模糊中间阶段假说的结果吗？这取决于当eRF1仍然识别这些框内有义密码子时，它们是否存在。然而，如果假设的将eRF1特异性拴在开放阅读框末端的机制（见上文）首先演化出来，那么这些终止密码子可能是在更类似于密码子消失或未分配密码子模型的情况下开始侵入编码序列的。值得注意的是，有假说认为，翻译系统"忽略"框内终止密码子的能力已经在所有纤毛虫的共同祖先中演化出来。然后它可以作为一种预适应，允许该系统以大规模并行的方式实现纤毛虫中演化出的多种多样的终止到有义重分配（图4）。一个概念上类似但机制不同的预适应案例可能促进了导致Blastocrithidia属的谱系偏离标准遗传密码。该属及其相关锥虫类的祖先丢失了无义介导的RNA降解途径的关键组分，这可能为后来Blastocrithidia中框内终止密码子的扩散铺平了道路。
此外，当谈论密码子重分配时，我们通常只是将其与标准遗传密码进行比较，忽略了现存状态可能源于比简单地从一种含义切换到另一种更为复杂的历史的可能性。确实已有令人信服的案例记录在案，表明次级密码子重分配是从那些本身含义已经偏离标准遗传密码的密码子演化而来的。例如，精氨酸AGA/AGG密码子最有可能在两侧对称动物共同祖先的线粒体中被重分配给丝氨酸，但其中一个或两个在特定的两侧对称动物谱系中进一步改变了它们的含义，以编码其他氨基酸，甚至作为终止密码子（图2）。另一个案例可能是钟虫类纤毛虫核基因组中编码谷氨酸的UAA/UAG（UAR）密码子，这通常被归类为终止到有义重分配。钟虫类在系统发育上嵌套在所有将UAR解码为谷氨酰胺的纤毛虫谱系之中，这一事实表明，从演化角度看，这代表了一次有义到有义的重分配。值得注意的是，这种次级密码子重分配原则上可能导致向标准遗传密码的回归，例如在某些两侧对称无脊椎动物的线粒体中，AUA被正常解码为异亮氨酸，尽管事实上AUA在大多数两侧对称动物中编码甲硫氨酸，并且很可能是整个类群的祖先状态。
最后，一个突出的问题出现了：密码子重分配是适应性的，赋予生物体特定的优势，还是它们反映了一种非适应性的演化模式？密码子消失假说在原则上是选择中性的，变化的方向性由持续的突变压力决定。相反，在模糊中间阶段和未分配密码子模型下出现的中间阶段预计会遭受适应度降低，这是由于产生了带有"错误"氨基酸的蛋白质，或者在翻译过程中对特定密码子的解码效率低下。恢复到原始状态（就密码子含义而言，但不一定是实现它的相同机制）或许通常是自然选择偏好的结果，并且可能是最常见的命运，尽管直接观察到此类案例几乎是不可能的。然而，如果所涉及的密码子数量或受影响的蛋白质数量很少，那么模糊中间阶段或未分配密码子假说中中间阶段的选择劣势可能相对较小，这一思想被概括在蛋白质组约束概念中。通常，选择强度可能至少是暂时性地降低，这取决于群体遗传参数（特别是有效群体大小，Ne），从而允许通过遗传漂变固定轻微有害的遗传变异。最近对游仆虫（Euplotes）基因组中移码位点（表现为非三联体遗传密码特征，见上文）扩散的分析，提供了一个遗传漂变战胜弱选择的惊人证明。
因此，作为中性演化结果的密码子重分配或许是普遍情况，或者至少是零模型。认识到这一点强调了当前对演化变化的非适应主义解释的普遍重新评估，正如构建性中性演化理论所体现的那样。尽管如此，由选择导致的遗传密码变化至少仍然是一种理论上的可能性。所谓的"基因组精简假说"（该术语并非原始思想作者本人使用）假设，密码子可能由于翻译机器的适应性简化而被重分配，这种简化源于对更小基因组的选择，据推测这主要在内共生体和寄生虫中起作用。也有人提出，密码子重分配可以作为抑制意外出现的框内终止密码子影响的机制，或者为了更好匹配线粒体蛋白质的氨基酸需求而被选择出来。针对线粒体中常见的AUA密码子Ile到Met重分配，提出了一个有趣的假说：具体来说，由此导致的线粒体蛋白质中甲硫氨酸含量的增加赋予了对抗氧化应激的优势。上述酵母中tRNALeuCAG的反复丢失，或许可以解释为对一种特异性靶向该tRNA的杀手质粒编码毒素的反应。确实，这个假定的由与传染源相互作用导致遗传密码变化的例子，可能只是一个更普遍演化反应的特例，特别是针对病毒带来的威胁。尽管感染特定宿主的病毒通常会通过与宿主谱系共同演化来适应遗传密码的变化，但拥有非规范遗传密码的生物体可能受到保护，免受从其他宿主转换过来的新病毒的定植。
人工遗传密码：超越自然极限
尽管已知自然发生的、偏离标准遗传密码的范围令人惊叹，但据推测，在机制上可行的替代方案的数量要高出几个数量级。这种可能的改变不仅包括任何蛋白质源性氨基酸或翻译终止信号与特定密码子的额外组合，还包括一个主要的变化类别，即将其翻译插入新生多肽的氨基酸列表扩展到已知的22种天然氨基酸之外（或者23种，如果考虑到细菌和细胞器会共翻译掺入甲酰甲硫氨酸，这使得教科书上的经典说法在技术上并不完全正确）。尽管对原核生物基因组的生物信息学筛选并未识别出非标准氨基酸，但值得注意的是，经常发现编码不寻常tRNAs的基因以及具有尚未探索功能的各种合成酶的额外旁系同源物。此外，事实上已知自然界中存在一种将非蛋白质源性氨基酸（磷酸丝氨酸）连接到tRNA上的合成酶，尽管它仅作为半胱氨酰-tRNA间接合成的一部分发挥作用。另外，几十年来已知合成酶可以将其关联氨基酸的结构类似物构建进去。一个例子是甲硫氨酸类似物叠氮高丙氨酸，用于大肠杆菌的实验研究，尽管为了实现显著的掺入水平，必须首先使甲硫氨酸营养缺陷型菌株缺乏甲硫氨酸。使用类似方法，使得在酿酒酵母中异源表达的蛋白质中，有近一半在其氨基末端特异性掺入了非经典甲硫氨酸类似物高炔丙基甘氨酸和正亮氨酸。事实上，已有超过90种被天然合成酶识别并加载到tRNA上的非经典氨基酸被记录在案，其中大多数具有翻译能力。因此，关于在任何生物体中是否演化出了基于tRNA的、在生理上相关（适应性）的将非经典氨基酸插入蛋白质的机制，目前尚无定论。
然而，演化可能未能实现的，人类的创造力已在蓬勃发展的合成生物学领域成功实施。利用不断扩展的方法，合成生物学家能够创建具有前所未有的密码子-氨基酸耦合、高度特异性的非经典氨基酸遗传编码，甚至将密码子组扩展到64个天然密码子之外的人工遗传密码。诚然，大多数此类操作迄今为止仅在大肠杆菌中完成，但在哺乳动物细胞中操纵遗传密码的可能性也在迅速扩大。最近已发表了许多涵盖该领域不同方面的综述，因此下面我们仅对人工遗传密码进行简要概述，并在相关处与自然遗传密码进行比较和对比。
实施人工遗传密码的一个关注点是提供能够表达所需非天然含义的密码子。更传统的方法是利用基因组中天然不存在的密码子，或者通过压缩模型系统的密码来释放出用于非天然用途的密码子。后者是通过在基因组范围内用同义密码子系统性替换目标密码子，并删除或修改其关联解码器（tRNA或释放因子）来实现的。然后，可以将该密码子以新的含义重新引入系统，从而模拟遵循密码子消失场景（见上文）的密码子重分配事件。例如，在大肠杆菌中，通过用UAA替换UAG并结合删除RF1，以及分别向RF2引入特异性突变，实现了UAG和UGA终止密码子的这种释放。值得注意的是，这种人工设计的、阻止UGA解码的功能丧失性RF2突变，在自然演化中没有已知的类似情况（图5）。全基因组范围内的遗传密码压缩，包括消除多个密码子，迄今为止仅在大肠杆菌中有报道，但没有明显理由表明更大量重构的细菌，乃至最终其他生物体，不能存活。主要的候选者是酿酒酵母，并且正在开展工作以在模式绿藻莱茵衣藻中实现密码子压缩的质体基因组。
另一种更具冒险性的遗传密码扩展方法依赖于将非标准密码子引入遗传系统。至少有三种方案正在开发和测试中：四碱基（四联体）密码子，其中256个版本是潜在可用的；通过可以形成特定碱基对（与G:C和A:T/U并行）的额外核苷酸来扩展遗传字母表，从而产生额外的密码子；以及在RNA密码子扩展策略中，实施包含非标准核苷假尿苷（Ψ）的密码子的转录后实现，该策略最近已在哺乳动物细胞中实施。后一种方法依赖于专门设计的指导snoRNA，这些snoRNA在目标mRNA的期望位置引入的框内终止密码子中，控制尿苷转录后转化为Ψ，将其转换为非标准的ΨAG、ΨAA或ΨGA密码子，然后由专门设计的关联tRNA解码。
当然，并非所有对遗传密码的操纵都会引入非经典氨基酸，这类操纵的结果可能类似于自然演化的遗传密码变体，即将特定密码子重新分配给标准氨基酸之一。例如，在提供嵌合tRNA（这些tRNA携带上述氨基酸之一，但具有与UCA和/或UCG关联的反密码子）的密码子压缩大肠杆菌菌株中，两个丝氨酸密码子UCA和UCG被人为重分配给丙氨酸、组氨酸、亮氨酸或脯氨酸。值得注意的是，自然界中未知这些密码子的此类特异性重分配（表S2）。然而，操纵遗传密码背后的主要动机以及合成生物学最重要的前景之一，是遗传密码扩展以允许掺入非经典氨基酸的可能性。目前，合成生物学家已采用了超过300种此类氨基酸的广泛集合（图7和表S3），甚至包括在正常翻译过程中 notoriously 难以掺入的β-氨基酸。核糖体翻译具有非凡的灵活性，α-羟基酸和α-硫代酸也可以被使用，从而在蛋白质骨架中局部用（硫代）酯键替代肽键。这类（氨基）酸可以在原核生物和真核生物中共翻译插入生长中的多肽链，并赋予蛋白质广泛的新化学性质。迄今为止，通过结合使用被释放的三联体密码子和添加的四联体密码子，已能高效并行掺入多达四种非经典氨基酸。
图7 遗传密码的人工操纵
展示了通过非天然密码子将标准氨基酸掺入蛋白质的若干案例，以及通过标准或非天然密码子掺入非经典氨基酸甚至羟基酸的案例。效率/特异性范围可以从具有低人工掺入率（与其天然解码相比）的多义密码子，到具有高掺入率的专用密码子。图标描绘了所使用的系统：人类、酵母、细菌细胞、无细胞提取物（以烧杯图标表示）；病毒图标表示使用非天然氨基酸的噬菌体展示实例。CbzK，化学笼蔽的赖氨酸类似物；TCOK-a，反式环辛烯笼蔽赖氨酸的轴向异构体。GXU和CYA（X = NaM，Y = TPT3；化学结构见Fischer等人）是非天然碱基对的示例。NaM和TPT3可以互换地作为mRNA或tRNA的一部分。NaM可以与其自身配对。然而，并非所有配置都有效。∗所涉及的β-氨基酸、α,α-二取代氨基酸和β-羟基酸的化学结构可在Dunkelmann等人的扩展数据图2中找到。#一个早期例子：α-羟基酸对羟基-L-苯基乳酸¹⁷⁷。使用无细胞提取物，可以掺入更多不同的α-羟基酸。关于缩写、参考文献和其他细节的更多信息可在表S3的扩展列表中找到。
因此，现在可以通过核糖体翻译来生产由DNA序列定义的、具有许多新功能的非天然生物聚合物。例如，非经典氨基酸的位点特异性整合使得能够：使用光活性氨基酸研究蛋白质相互作用；使用同位素标记的氨基酸促进蛋白质结构研究；开发旨在打破对引起疾病的天然蛋白质的免疫耐受的治疗性疫苗；生产旨在选择性靶向病变组织或肿瘤细胞的治疗性蛋白质；以及防止蛋白质降解、稳定药物和构建更好的催化剂，新的应用正在涌现。原则上，合成生物聚合物所承诺的看似无限的可能性，主要是在医学和生物催化领域，也可能产生完全生物防护的、完全免受病毒侵害的生物体，以及具有标准遗传密码的生物体。
非经典氨基酸遗传编码的关键要素是开发正交分子机器的能力，这些机器将确保目标密码子按预期解码，主要是tRNA-合成酶对。不干扰经典组使用的此类配对的数量正在迅速增加，为这些化合物的日益广泛使用奠定了基础。迄今为止，已有多达五对这样的相互正交的配对被并行引入大肠杆菌¹⁸¹。通常，最好的正交tRNA-合成酶对来源于与将要使用它们的生物体在演化上尽可能遥远的生物体，利用它们广泛分化的身份元件。真正对该领域产生变革的是对tRNAPyl–合成酶对独特性质组合的利用，该配对现在以多种变体形式被用作该领域主要的人工正交分子机器（综述见¹⁸⁵）。原则上，它在生命之树大片区域中的缺失确保了在各种目标生物体中具有良好的正交性。默认情况下，tRNAPyl识别UAG终止密码子，因此该密码子在用于非经典氨基酸遗传掺入的密码子中占主导地位（图7）。关键的是，该合成酶能容忍其底物tRNA中反密码子的改变，从而拓宽了可以这种方式利用的密码子集合，并且具有一个大的、混杂的（低特异性）活性位点，天然能够用多种非经典氨基酸加载tRNAs。多年来，这种能力被进一步操纵以扩展可能性范围，涉及非经典氨基酸掺入以及正交性两个方面。
除了利用演化产生的分歧，还可以使用物理分离来获得"空间正交性"。这方面的例子可以在所谓的半合成真核细胞中找到，它们通过相分离和空间靶向，能够最小化对宿主翻译机器的干扰。使用一个RNA靶向系统，可以将一个专用的tRNA和一个经过工程改造以编码非经典氨基酸的mRNA在近距离内聚集在一个无膜的、正交翻译的、合成的设计者"细胞器"中。作为该领域最大的挑战之一，某些遗传密码扩展策略，例如使用四联体密码子的策略，需要实施一个特殊设计的正交核糖体，该核糖体与天然核糖体并行运作，并被设计为仅翻译正交mRNAs。惊叹于这项技术的复杂性，我们结束对这一最引人入胜的科学事业领域的简要探讨。
结论与展望
特别是随着目前正在进行的单细胞真核生物大规模基因组和蛋白质组研究，很可能会发现新的、独立演化的已知自然密码变体实例和新的密码子重分配。然而，我们也能察觉到回报递减的明显趋势。值得指出的是，虽然已发现19个三联体发生了自然重分配，但未发生重分配的三联体数量是其两倍多（45个）（图1）。重分配也并非随机：值得注意的是，所有以G开头的密码子似乎都未被触及。这19个密码子组成的群体高度非典型：其中三个是终止密码子，14个构成了编码精氨酸、亮氨酸和丝氨酸的三个六密码子组的一部分。终止密码子可能更容易改变，因为原则上每个阅读框它们只出现一次，而编码相同氨基酸的六个三联体的极端冗余性可能适应后一类群体中偶尔的三联体丢失。因此，蛋白质组约束可以按照本综述描述的思路被克服，但大多数三联体的含义似乎抵抗改变。然而，在这种含义维持的背后，常常涉及完全不同的因素，因为自然界经常交换复杂分子机器的随机部件。本综述侧重于导致重分配的实例。实际上，所有这些改变都可以在中性框架内理解，但选择优势可能偶尔参与其中。
如果随机过程能够改变某些遗传密码的含义，那么定向开发应该为更广泛的操作打开密码之门。事实上，就人工密码的出现而言，一场革命似乎即将到来。关键的第一步将是创建一个64密码子的非简并密码。这将使我们能够编码和生产具有高度特异性的多功能人工蛋白质，其化学能力以及技术和治疗应用目前难以完全把握。确实，人工密码的性质和范围可能更多地受限于我们有限的想象力，而非翻译机器的适应性。未来看起来硕果累累且充满灵活性。
在本综述定稿和编辑期间，该研究领域出现了几项重要研究。一项研究在 Pedinophyceae（绿藻）的线粒体和甲藻（具有源自 pedinophyte 的次级质体）的质体中发现了新的密码变体，包括首次报道的质体中有义到终止的重分配（表S1和S2）。另一个新发现：一些核质病毒门（Nucleocytoviricota）的大型真核病毒也采用非标准遗传密码，包括一些尚未在病毒中报道过的密码¹⁹³。在人工遗传密码领域，Chin及其同事构建了一个大肠杆菌基因组，用同义密码子替换了六个有义密码子和一个终止密码子的所有实例。由此产生的生物体仅使用55个密码子来编码20种经典氨基酸。
致谢
我们感谢利奥什·瓦拉谢克（布拉格微生物研究所）和兹德涅克·帕里斯（生物学中心）进行的讨论，以及维罗妮卡·普兰特洛娃（生物学中心）在图表方面提供的帮助。我们因篇幅所限，未能涵盖和引用遗传密码演化领域的许多其他重要研究，深感遗憾。这项工作得到了捷克科学基金会资助 23-06479X（授予 J.L.）和 23-05764S（授予 M.E.），以及欧洲区域发展基金 16_019/0000759（授予 J.L. 和 M.E.）的支持。
Citation
Natural and artificial variations of the standard genetic code
Lukeš, Julius et al.
Current Biology, Volume 35, Issue 22, R1104 - R1126
全文翻译由DeepSeek模型驱动生产。