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博腾生物LC-MS技术平台，助力基因治疗产品的开发与表征

博腾生物

2023-02-24

导读：基因治疗产品检测利器——LC-MS技术平台

基因治疗是指利用分子生物学方法将外源目的基因（DNA/RNA）导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或异常引起的疾病；或通过向细胞内导入核酸以沉默或激活目的基因，从而达到治疗目的。

目前基因治疗在恶性肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病和罕见病等治疗领域已展现出巨大的潜力。^{[1, 2]} 不同种类的基因治疗产品，由于结构特点和质量属性差异较大，其对应的质控方法和质量标准也具有较大的复杂性。因此，各国医药管理当局和权威机构对这种新型的治疗方式也给予了高度重视。目前，FDA、EMA、NMPA及ICH等均已颁布了多个针对基因治疗研究的指导原则或技术指南，并开发了大量可准确、高效评价基因治疗类产品安全性的技术。高效液相色谱质谱（LC-MS）技术由于具有出色的灵敏度和专属性，已被广泛应用于多种基因治疗产品的工艺开发和表征中。

LC-MS在基因治疗产品中的应用

AAV衣壳蛋白的表征

重组腺相关病毒（rAAV）因其具有毒性低、靶向性强、表达能力持久等优势已成为基因治疗领域中最为广泛关注的病毒载体之一。^[3] AAV的衣壳主要由VP1、VP2和VP3组成，比例约为1:1:10，质量范围介于50-85 kDa之间。已有研究表明，AAV衣壳组成是影响病毒感染活性和基因转导的关键因素。^{[4, 5]} 在FDA发布的CMC指南中，提出了需对AAV衣壳蛋白进行全面表征，包括衣壳的鉴别、衣壳纯度、序列和翻译后修饰（PTM）等。^[6]

由于AAV样品滴度限制，用于后续表征的衣壳蛋白量相对有限，LC-MS能够通过单个/次表征分析获取诸多的质量属性信息，如衣壳VP蛋白的比例和纯度、衣壳蛋白覆盖率及PTM等。博腾生物搭建了完善的分析表征平台可用于rAAV产品的全面表征分析，图1是AAV9变性衣壳蛋白的TIC图谱及VP蛋白分子量结果，在TIC图谱中可以看到3种VP蛋白的比例和纯度，VP3蛋白的异构体和截断形式，通过去卷积获取的准确分子量可以用于衣壳蛋白的鉴别。此外，测定变体的准确质量数有助于对VP蛋白上潜在的PTM进行归属，如图中的磷酸化修饰。

图1 AAV9变性衣壳蛋白的TIC图谱及VP蛋白分子量结果

（图谱源于博腾生物表征平台）

在对VP蛋白进行鉴定的基础上，通过LC-MS/MS可以对VP蛋白进一步表征，包括序列覆盖度、PTM鉴定和未知峰/杂质（如HCP）鉴定等。如图2所示，采用胰蛋白酶（trypsin）对AAV9衣壳蛋白VP1酶切后进行肽图分析，可以获得86%的序列覆盖度；并对潜在的PTM进行鉴定，包括N-端乙酰化、磷酸化和氧化等修饰。由于trypsin酶切位点在AAV衣壳蛋白序列中的限制性，使用trypsin难以获得100%的VP1蛋白序列覆盖，为了获得更高的蛋白序列覆盖率，可考虑与其它酶（如胃蛋白酶（pepsin））联合使用的方法进行酶切处理。 ^[7]

图2 AAV9的VP1序列覆盖图及高质量MS/MS图（Trypsin酶切）

（图谱源于博腾生物表征平台）

mRNA加帽率及poly(A)尾分析检测

相比传统疫苗，mRNA疫苗成本低、研发灵活性高、生产效率高，且具有相对较高的安全性。^[8] 对于此类新型疫苗，需严格的质量控制以确保产品的安全性。因此，为了进一步加强对mRNA类基因治疗产品的质量控制，NMPA发布了“体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）”，美国药典（USP）发布了关于“mRNA疫苗质量分析方法的指南草案”等指导文件。这些指导原则明确对mRNA不同区域结构的完整性提出了要求，如5'-Cap帽或帽类似物结构和poly(A)长度及分布等。

在mRNA工艺生产中采用2种类型的加帽方式：酶法加帽和共转录加帽。酶法加帽反应的终产物是m7GpppmGpG-RNA，中间产物包括m7GpppGpG-RNA，ppGpG-RNA，pGpG-RNA以及GpppGpG-RNA等；共转录加帽反应的终产物是m7GpppmGA-RNA。大多数研究数据显示酶法加帽的效率要优于共转录加帽，但酶法加帽存在诸多的中间产物，对mRNA产品加帽率的分析和控制方法提出了更高的要求。LC-MS由于其高分辨率、高灵敏度及高质量精度等优势，已成为表征评估mRNA加帽率及加尾分析的有效手段之一。

图3是博腾生物表征平台利用LC-MS对共转录加帽反应的mRNA样品进行加帽率检测的TIC图谱。全长的mRNA由于分子量太大而无法得到精确表征，通常会使用酶切方式获得5’端的加帽或未加帽结构的寡核苷酸片段后再进行LC-MS检测。^[9] 图3中Rt 6.71min对应的是酶切获得的寡核苷酸片段，通过对加帽或未加帽结构的组分进行质谱峰面积定量，从而可以得到5’加帽比例。

图3 mRNA样品加帽率检测的TIC图谱及加帽或未加帽组分列表

（图谱源于博腾生物表征平台）

mRNA的3’端poly(A)尾结构可以让mRNA在细胞中免受核酶的降解，增强mRNA的稳定性，同时poly(A)结构长度可以控制转录效率。图4为mRNA样品不同长度的poly(A)质谱图及分布图，可以看出，LC-MS可以准确的检测mRNA尾部poly(A)的长度及不同长度A的占比。

图4 mRNA样品不同长度的poly(A)质谱图及分布图

（图谱源于博腾生物表征平台）

随着基因编辑技术、载体改造技术的逐渐成熟，目前基因治疗产品在国内外已有多款产品上市，同时也有诸多候选产品进入临床阶段，全球的基因治疗领域快速升温。为帮助客户解决基因治疗产品表征难的问题，博腾生物搭建了完善的分析表征平台，建立了LC-MS，AUC等多个分析表征方法，可为客户提供rAAV、mRNA等产品的分析表征检测服务。

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博腾生物分析检测与咨询服务

自成立以来，博腾生物与客户携手奋进，砥砺前行，现阶段已有多个客户的项目进入中国Pre-IND阶段或取得IND默许批件。

完善的分析检测平台，为博腾生物端到端的基因与细胞治疗CDMO服务提供强大的支持，目前已为超过20个CGT管线提供基于DOE的分析方法开发和高效精准的检测服务。

博腾生物基于丰富的CMC药学研究与成功经验，以客户需求为导向，开发了针对质粒、病毒、细胞、mRNA及活菌等不同种类GCT产品的系统化平台检测方法，截至目前已超过300项。

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1.IND申报分析方法开发与检测服务

旨在应对客户IND申报过程中的法规合规性、质量体系合规性、申报资料繁琐性、人员培训和前期大量设备投资的挑战。
博腾生物提供一站式IND申报分析研究与检测的策略、执行和项目管理服务。

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旨在应对非注册临床阶段对IIT产品分析检测时效性、准确度及方法稳健性要求极高的挑战。
博腾生物提供一站式、针对非注册临床产品的分析研究与检测的策略和执行服务。

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提供合规性检测和普通检测服务，分别覆盖临床到商业化，药物研发到商业化阶段。
博腾生物成功开发了针对质粒、病毒、细胞、mRNA及活菌等不同种类GCT产品的系统化平台检测方法，截至目前已超过260项。

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4.客户定制服务

博腾生物具备完善的分析检测平台、专业的检测团队及多样化的高端分析检测仪器设备，可根据客户需求提供个性化定制，包括复有需求针对性的方法开发定制服务及灵活性高的服务项组合方案。

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5.技术咨询服务

基于丰富的国内外法律法规知识与多项申报经验，博腾生物可提供个性化技术咨询和培训服务，为客户提前规避风险，梳理申报困惑，从而进行更高效的基因与细胞疗法的申报策略规划。

参考文献

[1] Naldini L. Gene therapy returns to centre stage [J]. Nature, 2015, 526(7573): 351-360.

[2] Collins M, Thrasher A. Gene therapy: progress and predictions [J]. Proc Biol Sci, 2015, 282(1821): 20143003.

[3] Finer M, Glorioso J. A Brief Account of Viral Vectors and Their Promise for Gene Therapy. Gene Ther, 2017; 24: 1-2.

[4] Girod A, Wobus C.E, Zadori Z. et al. The VP1 Capsid Protein of Adeno-Associated Virus Type 2 is Carrying a Phospholipase A2 Domain Required for Virus Infectivity. J Gen Virol, 2002, 83: 973-978. ，

[5] Popa-Wagner R, Porwal M, Kann M. et al. Impact of VP1-Specific Protein Sequence Motifs on Adeno Associated Virus Type 2 Intracellular Trafficking and Nuclear Entry. J Virol, 2012, 86: 9163-9174.

[6] FDA Guidance for Industry: Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs), January 2020.

[7] Toole E.N, Dufresne C.P., Ray S. et al. Rapid Highly Efficient Digestion and Peptide Mapping of Adeno-Associated Viruses. Anal. Chem. 2021, 93(30), 10403-10410.

[8] Norbert, P. et al. Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics. Nat Rev Drug Discov, 2018, 17(4), 261-279.

[9] Beverly M, Dell A, Parmar P. et al. Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal. Bioanal. Chem. 2016, 408, 5021-5030.

关于博腾生物

苏州博腾生物制药有限公司成立于2018 年12月，立足于苏州工业园区，以上市公司-重庆博腾制药科技股份有限公司（股票代码：300363）为依托，搭建了质粒、细胞治疗、基因治疗、溶瘤病毒、核酸治疗及活菌疗法等CDMO平台，提供从建库，工艺方法及分析方法开发，cGMP生产到制剂灌装的端到端服务，贯穿药物不同研发阶段，帮助客户加快药物研发与上市进程。

博腾生物聚焦基因与细胞治疗，在博腾股份的成功经验之上，以国际一流的专业人才为核心，秉承“客户第一”的服务宗旨，以“合规、专业、专注、开放协作”为品牌理念，延续母公司强大的IP保护和项目管理机制以及完善的质量管理体系，充分利用核心团队将基因和细胞治疗产品推向临床直至上市的成功经验，为全球客户提供优质和高效的服务，让好药更早惠及大众。

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博腾生物立足苏州工业园区，以上市公司-重庆博腾制药科技股份有限公司（股票代码：300363）为依托，打造基因细胞治疗从药物发现到工艺开发到生产的CRO+CDMO一体化的服务平台，让好药更早惠及大众。

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博腾生物博腾生物立足苏州工业园区，以上市公司-重庆博腾制药科技股份有限公司（股票代码：300363）为依托，打造基因细胞治疗从药物发现到工艺开发到生产的CRO+CDMO一体化的服务平台，让好药更早惠及大众。

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