6.9-10日，2023中国基因与细胞治疗青藜风云论坛
即将开启，欢迎报名参加！
近年来，随着重组腺相关病毒 (rAAV) 载体广泛应用于体内基因治疗，其相关工艺研究样品的分析表征和质量控制越发受到审评机构重视。例如在AAV产品的临床用药安全和有效剂量研究中，样品的精确量化是数据分析的基础，关键质量控制包括滴度检测、纯度分析、靶序列鉴别等。病毒的基因组滴度是一个关键质量属性，同时也是临床给药量的重要基础，因此需要采用准确度较高的方法进行基因组滴度的检测。
ddPCR(droplet digital PCR)技术的萌芽与发展给上述问题带来了解决方案。ddPCR技术在PCR扩增前对样品进行微滴化处理，将含有待测样品的反应体系分成上万个纳升级的微滴。通过PCR仪对靶基因进行扩增和信号放大，再使用微滴分析仪根据检测通道对液滴逐个进行荧光检测。根据泊松分布原理及阴阳性微滴的分析，即可实现靶基因的起始拷贝数或浓度的测定。由于不需要标准曲线，ddPCR方法被称为是绝对定量方法，可以避免使用qPCR进行rAAV基因组滴度检测的标准品相关问题，准确性更好。此外，就检测的批内和批间精密度而言，ddPCR在检测rAAV基因组滴度方面也优于qPCR，并且对样本或制剂含有的潜在反应干扰物具有更强的抗干扰能力，检测灵敏度可以达到10 copies/反应或更低。
除了在绝对定量上得天独厚的优势，使用ddPCR对同一rAAV样品的不同位点进行标记，还能够实现rAAV样品的基因组完整性分析。如果可以进一步证明rAAV的完整基因组滴度与rAAV样品转导活性的关系，甚至能够将ddPCR方法发展成为转导活性检测的替代方法。
除了在rAAV上的应用，ddPCR的检测手段也可以应用在细胞治疗产品和mRNA的质量控制上。在细胞治疗产品中，Car细胞拷贝数/插入基因阳性率对于治疗效果也是非常关键的质量属性，通过设计靶标基因和内参基因，使用ddPCR技术对2个基因进行绝对定量，避免标准曲线校准及扩增效率的影响，CAR拷贝数结果准确度高，重复性好。并且也可以直接将细胞进行液滴包裹，形成单细胞的液滴，通过PCR扩增和液滴的信号收集，从完整细胞的角度进行插入基因的分析，获得细胞样品的插入基因阳性率检测结果，与CAR拷贝数检测一同在基因水平进行转导效率的研究，同时与蛋白水平流式细胞荧光分选技术（FACS）共同分析，可更好的支持工艺开发与优化，保证产品的有效性。
ddPCR技术不仅在AAV和Car-T产品中具有广泛的应用，而且在质粒、活菌和mRNA等产品的质量分析中也扮演着非常重要的角色。博腾生物分析检测部门的ddPCR平台自成立以来，成功开发出多种运用于rAAV、细胞产品（如Car-T、MSC）、mRNA、质粒和活菌产品的检测方法，在ddPCR分析方法开发和验证上具备充足的经验。
1. 标准品定量及AAV基因组滴度检测
图1为标准品梯度稀释试验，结果表明定量限可低至20拷贝/反应，检测限可至5~10拷贝/反应，ddPCR方法能更好的用于标准品的定量和残留检测。
图2为AAV基因组滴度检测的代表性图谱，通过对AAV样品的前处理，再通过ddPCR系统进行液滴生成并进行PCR扩增后读取液滴信号，结果表明博腾生物使用ddPCR对病毒滴度进行检测，其结果阴阳性区分明显，易于分析，结果准确，并且相同样品不同天检测CV值≤10%。
2. 插入基因阳性率/CAR拷贝数检测
表1. 细胞完整率及插入基因阳性率汇总表
图3为插入基因阳性率检测的代表性图谱。通过加入细胞样品生成液滴实现液滴包裹细胞后进行检测，结果表明博腾生物使用ddPCR方法对细胞进行检测时，细胞完整率高，干扰少，阳性率结果准确、稳定，细胞完整率＞97%。
图4为CAR细胞拷贝数检测的代表性图谱。通过设计特异引物进行扩增，由图4可看出，各信号团聚团，无散点，易于分析，结果稳定可靠。
3. mRNA Poly A 加尾率分析
图5. mRNA Poly A加尾率
表2. mRNA Poly A加尾率分析数据汇总
图5为ddPCR方法分析mRNA Poly A加尾率的代表性图谱。将mRNA分子进行液滴包裹，通过不同区域液滴占比，以及数据分析，计算出带有Poly A的mRNA和总mRNA数量。由结果分析，阴性样品无干扰，Poly A尾检测专属性好，特异性强。并通过不同类型样品混合进行加标回收率实验，方法加标回收率在70%~130%之间，结果准确可靠。
如您有ddPCR
或其它检测服务需求
欢迎扫码登记
我们将第一时间联系您
博腾生物分析检测与咨询平台推出ddPCR方法开发和检测服务，为客户提供解决GCT产品分析质控难点的新思路。
拷贝数检测
残留DNA/RNA分析
标准品定量
基因编辑效率
突变检测，基因表达
mRNA ploy A与完整性分析
1. AAV滴度检测
2.CAR拷贝数检测
3.CAR阳性率检测
4.DNA定量检测
5.CHO基因拷贝数检测
6.拷贝数变异、基因表达分析
旨在应对客户IND申报过程中的法规合规性、质量体系合规性、 申报资料繁琐性、人员培训和前期大量设备投资的挑战。
博腾生物提供一站式IND申报分析研究与检测的策略、执行和项目管理服务。
旨在应对非注册临床阶段对IIT产品分析检测时效性、准确度及方法稳健性要求极高的挑战。
博腾生物提供一站式、针对非注册临床产品的分析研究与检测的策略和执行服务。
提供合规性检测和普通检测服务，分别覆盖临床到商业化，药物研发到商业化阶段。
博腾生物成功开发了针对质粒、病毒、细胞、mRNA及活菌等不同种类GCT产品的系统化平台检测方法，截至目前已超过300项。
博腾生物具备完善的分析检测平台、专业的检测团队及多样化的高端分析检测仪器设备，可根据客户需求提供个性化定制， 包括复有需求针对性的方法开发定制服务及灵活性高的服务项组合方案。
基于丰富的国内外法律法规知识与多项申报经验，博腾生物可提供个性化技术咨询和培训服务，为客户提前规避风险，梳理申报困惑，从而进行更高效的基因与细胞疗法的申报策略规划。
