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CGT产品生物学活性分析方法难点解析——Potency Assay

博腾生物

2023-04-06

近些年来，细胞和基因治疗（Cell and Gene Therapy, CGT）正在经历着快速发展阶段，吸引着众多生物医药行业从业者关注的目光，是业内最前沿的研发方向之一。细胞治疗是指将供体的细胞在体外经过改造或（及）扩增再回输病人体内达到治疗目的的一类方式，主要包括免疫细胞疗法和干细胞疗法，其中免疫细胞疗法主要分为CAR-T、CAR-NK、TIL和TCR-T疗法。截止至目前，全球已经有8款CAR-T细胞治疗产品上市。基因治疗是指利用分子生物学方法将外源目的基因（DNA/RNA）导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或异常引起的疾病，其中病毒载体类AAV基因治疗产品截至目前在全球有6款上市产品，在国内有17个获批IND。另外Pfizer/ BioNtech和Moderna的mRNA新冠疫苗应用也给核酸类基因产品在疾病预防和治疗方面带来了更多的希望。

依据各国出台关于CGT产品的相关法规及指导原则要求，CGT产品必须要对其含量、纯度、安全性、稳定性及活性等指标进行质量分析控制。由于CGT产品通常含有各自独特且复杂的多种活性成分，对于能够反映此类产品作用机理（Mechanism of Action, MOA）的potency assay在美国食品药物管理局（FDA）、欧洲药品管理局（EMA）及中国国家药品监督管理局(NMPA)监管机构出台的文件中明确提及到需用适当的检测方法来控制CGT产品的功能活性。

考虑到CGT产品的本身成分的复杂多样性，监管机构建议使用多种分析方法(assay matrix)从不同维度来分析产品的potency。另外在CGT产品不同的研发阶段，potency assay的表现要求可以存在不同。比如产品处于工艺开发阶段，由于工艺参数尚处于筛选和优化阶段中，存在不确定性，而且potency assay本身也在设计和开发阶段，所以这个阶段方法的准确度、精密度等要求可以适当放宽。而在临床中后期阶段，这些要求应该收窄并且需要做全面的验证，才能保证临床样品或上市产品在质量方面的准确性和一致性。

细胞治疗类产品如自体CAR-T由于供者本身的差异，外周血的采取和运输等环境因素不同，LV对于不同供者细胞感染效率差异导致产品变化均会对potency assay的结果带来波动。图1~3是博腾生物基于自体CAR-T产品的MOA，结合多种分析方法从细胞因子的分泌能力、与靶细胞共培养后CAR-T细胞的增殖能力、CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力等角度对CAR-T细胞的potency进行质量分析。截至目前，博腾生物已经服务多家客户，助力CAR-T类产品成功申报IND，在potency assay的方法开发、验证及转移等方面积累丰富的数据和经验。

图1. 细胞多因子分泌（LEGENDplex Assay）：同时检测效应细胞与靶细胞相互作用后分泌多因子：IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13等。

(图谱源于博腾生物）

图2. 肿瘤抗原刺激CAR-T细胞的增殖能力分析。A）TAA⁺肿瘤细胞（阳性靶细胞）刺激CAR-T细胞增殖能力分析（D6 vs D9）；B）TAA^-肿瘤细胞（阴性靶细胞）刺激CAR-T细胞增殖能力分析（D6 vs D9）；C）与D）TAA⁺肿瘤细胞、TAA^-肿瘤细胞与CAR-T细胞共孵育（效应细胞：靶细胞=1:1）,显微镜观察CAR-T细胞激活状态分析。（图谱源于博腾生物）

图3. CAR-T细胞对于靶细胞杀伤分析：RTCA（Real Time CelI AnaIysis，RTCA）实时监控CAR-T及NCT对不同靶细胞的杀伤，可见CAR-T细胞对不同靶细胞的杀伤效果不同，而NCT对各靶细胞基本均无杀伤作用。（图谱源于博腾生物）

除CAR-T细胞治疗产品外，近年来兴起的基因编辑和mRNA核酸类产品的potency assay也存在一定的挑战，《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》指出，生物学活性是反映产品质量和临床有效性的重要指标，需建立与产品体内作用机制相同或相关的生物学活性。基因组治疗类产品种类多且功能各异，需要基于产品本身的目的功能及现有的检测技术手段来设计/开发适用于特定产品的生物学活性评估方法。

目前，常通过基因治疗载体转导敏感细胞后表达产物引起的细胞表型或功能变化来评估产品的活性或效能。开发这些活性检测方法需要基于产品功能和特性“具体问题具体分析”，因为没有一种“放之四海而皆准”的检测方法供开发人员使用，例如有的可以通过定量表达产物的功能活性来测试产品的活性；有的产品因检测其产物活性存在困难而只能通过检测表达产物的物理含量来间接评估产品的活性和功能，例如通过Western Blot （如图4所示）、流式细胞术、ELISA等检测方法定量表达产物。对于已上市的AAV产品Zolgensma，针对产品的生物学活性主要从两方面进行了评估，一方面评估了靶细胞内目的蛋白的表达量，另一方面采用体内半定量检测的方法评估了小鼠的生存率。

图4. Western Blot方法检测AAV载体感染敏感细胞后表达的目的蛋白检测。（图谱源于博腾生物）

mRNA核酸治疗类产品（包括前述AAV等病毒载体类产品）的生物活性方法设计和开发总体策略可参考图5中的示意图进行开发：其生物学活性质控一般可以结合体外及体内活性综合评价，体外活性检测，通常采用体外转染哺乳动物细胞，检测其表达量的方法，检测手段多样化，如ELISA法、Western Blot、报告基因法、FACS法（如图6所示）测其目的蛋白表达、QPCR法测定其基因整合等；体内活性实验应根据产品的免疫反应原理设计实验，进行功能评价。

图5. 基因治疗产品生物活性分析方法开发策略示意图。（图谱源于博腾生物）

图6. 目的蛋白表达分析：mRNA转染哺乳动物细胞系，通过FACS法检测目标蛋白的表达。（图谱源于文献）

随着基因编辑、载体改造技术的逐渐成熟，目前细胞基因治疗产品在国内外已有多款产品上市，同时也有诸多候选产品进入临床阶段，全球的基因治疗领域快速升温。为帮助客户解决细胞基因治疗产品potency assay设计、开发、验证和问题排查难的问题，博腾生物搭建了完善的活性分析平台，基于产品的特性及博腾生物全面的分析检测手段，可为客户提供CGT产品的potency方法开发、优化、验证及放行检测等全面的定制化检测服务，欢迎广大客户垂询！

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博腾生物分析检测与咨询服务

自成立以来，博腾生物与客户携手奋进，砥砺前行，现阶段已有多个客户的项目进入中国Pre-IND阶段或取得IND默许批件。

完善的分析检测平台，为博腾生物端到端的基因与细胞治疗CDMO服务提供强大的支持，目前已为超过20个CGT管线提供基于DOE的分析方法开发和高效精准的检测服务。

博腾生物基于丰富的CMC药学研究与成功经验，以客户需求为导向，开发了针对质粒、病毒、细胞、mRNA及活菌等不同种类GCT产品的系统化平台检测方法，截至目前已超过300项。

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1.IND申报分析方法开发与检测服务

旨在应对客户IND申报过程中的法规合规性、质量体系合规性、申报资料繁琐性、人员培训和前期大量设备投资的挑战。
博腾生物提供一站式IND申报分析研究与检测的策略、执行和项目管理服务。

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旨在应对非注册临床阶段对IIT产品分析检测时效性、准确度及方法稳健性要求极高的挑战。
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提供合规性检测和普通检测服务，分别覆盖临床到商业化，药物研发到商业化阶段。
博腾生物成功开发了针对质粒、病毒、细胞、mRNA及活菌等不同种类GCT产品的系统化平台检测方法，截至目前已超过300项。

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4.客户定制服务

博腾生物具备完善的分析检测平台、专业的检测团队及多样化的高端分析检测仪器设备，可根据客户需求提供个性化定制，包括复有需求针对性的方法开发定制服务及灵活性高的服务项组合方案。

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5.技术咨询服务

基于丰富的国内外法律法规知识与多项申报经验，博腾生物可提供个性化技术咨询和培训服务，为客户提前规避风险，梳理申报困惑，从而进行更高效的基因与细胞疗法的申报策略规划。

参考文献

[1] FDA官网：https://www.fda.gov.

[2] CDE官网：https://www.cde.org.cn.

[3] EMA官网：https://www.ema.europa.eu.

[4] Guidance for Industry Potency Tests for Cellular and Gene Therapy, CDER, January 2011.

[5] EMA Guideline on the quality, non-clinical, and clinical aspects of gene therapy medicinal products, March 2018.

[6] ICH Q2(R1) Validation of Analytical Procedures.

[7] United State Pharmacopeia (2012) Chapters: <1032> Biological Assay Development, <1033> Bioassay Validation, <1034> Biological Assay Analysis.

[8] 《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》，CDE，2022.05.

[9] BNT162b vaccines protect rhesus macaques from SARS-CoV-2, Nature, 592, April 2021, 283-289

CGCT 2023

6月即将开启

点击图片查看最新大会议程

青藜论坛始终为细胞基因行业的青藜之士保驾护航。2023年第三届中国基因与细胞治疗青藜风云论坛（CGCT 2023），由博腾生物、佰傲谷BioValley 、BioBAY 联合主办，将于2023年6月9-10日在苏州召开。我们将持续聚焦中国细胞基因免疫治疗学术的最前沿，站在更高的高度、更深的广度，同与会各方一齐深度探讨与分享CGT的新成果，共论CGT领域的新时代。

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关于博腾生物

苏州博腾生物制药有限公司成立于2018 年12月，立足于苏州工业园区，以上市公司-重庆博腾制药科技股份有限公司（股票代码：300363）为依托，搭建了质粒、细胞治疗、基因治疗、溶瘤病毒、核酸治疗及活菌疗法等CDMO平台，提供从建库，工艺方法及分析方法开发，cGMP生产到制剂灌装的端到端服务，贯穿药物不同研发阶段，帮助客户加快药物研发与上市进程。

博腾生物聚焦基因与细胞治疗，在博腾股份的成功经验之上，以国际一流的专业人才为核心，秉承“客户第一”的服务宗旨，以“合规、专业、专注、开放协作”为品牌理念，延续母公司强大的IP保护和项目管理机制以及完善的质量管理体系，充分利用核心团队将基因和细胞治疗产品推向临床直至上市的成功经验，为全球客户提供优质和高效的服务，让好药更早惠及大众。

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博腾生物立足苏州工业园区，以上市公司-重庆博腾制药科技股份有限公司（股票代码：300363）为依托，打造基因细胞治疗从药物发现到工艺开发到生产的CRO+CDMO一体化的服务平台，让好药更早惠及大众。

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