近年来，随着Zolgensma在商业上取得逐步成功，越来越多的基于腺相关病毒（AAV）的基因疗法临床获批，为患者带来了新的治疗策略，开启了全新的治疗市场。
有介于不同AAV由于衣壳蛋白空间构象，序列，组织特异性等因素不同，因此如何使得AAV定向进化获得想要的AAV类型成为研究要点之一。本文将就AAV定向进化的文库构建技术进行简介。
腺相关病毒(AAV)是动物感染的最小病毒之一，具有大约20-26 nm的无包膜二十面体衣壳。它具有4.7 kb大小的线性单链DNA基因组，由三项基因元件组成。
其中，长145 bp的反向末端重复序列((ITR)位于两端 ，ITR对病毒的复制和包装具有决定作用，其外侧的126 bp是一个较长的回文样结构，自身能通过碱基配对方式进行折叠，使ITR呈发夹样结构，是AAV复制和包装所需的唯一顺式作用元件。
两个ITR之中为基因编码区，左右两侧的开放阅读框（ORF）含有rep基因和cap基因，Rep基因主要编码非结构蛋白,参与病毒复制、包装和基因组整合，而cap基因编码的结构蛋白VP1、VP2和VP3以一定比例组装形成60个亚单位组成的近球形蛋白质外壳,使病毒具有感染力。
尽管其在人群中的流行率约为80%，但AAV与任何人类疾病都没有联系，AAV载体利用病毒对细胞的感染能力，将携带的外源基因转移到细胞中，对长期基因矫正和基因治疗具有一定的优越性，因此成为传导目的基因的理想载体。
目前在人类和非人类灵长动物中已发现 13种 AAV 血清型。不同血清型以不同方式与血清蛋白、靶细胞表面受体发生相互作用，对组织的亲嗜性和表达强弱也不尽相同。
然而，尽管现有的AAV血清型已经在一定程度上提供了一系列的组织嗜性，但是在临床应用方面，这些血清型仍然面临递送效率偏低，脱靶，或人体预先具有AAV血清型中和抗体阻止AAV感染，AAV血清型生产滴度、纯度偏低等问题。例如，Spark公司的肝脏靶向药物，使用的一款管线肝脏感染效率高，用量少，然而，大约有一半的患者对该载体有抗体，因而这导致很多患者不能得益。
此外， 由于DNA序列直接影响后面病毒载体包装效率，这在用于小鼠实验的制备可能不是问题，但当用于大规模生产时有可能带来很大的成本问题，在药物申报审批方面，这有可能导致前期的成药性研究功亏一篑。
因此需要构建AAV文库，通过AAV定向进化筛选出基因递送能力、靶向能力、细胞类型特异性得到提升，例如能够穿过血脑屏障的能力或在玻璃体内转导的AAV。
定向进化是一种常用于提高生物大分子性能的高通量方法。该方法模拟自然选择过程并将其所耗时间大幅缩短。AAV衣壳定向进化通过各种方法突变野生型AAV衣壳基因，获得具备高度多样性的AAV衣壳文库，然后从中筛选出全新的、性能更优越的AAV衣壳。目前用于构建AAV定向进化筛选文库的技术主要有DNA shuffling技术，易错PCR技术，多肽插入技术等。
易错PCR
易错PCR是指通过改变PCR反应条件（如提高镁离子浓度，加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等）来调整PCR反应中的突变频率，降低聚合酶固有的突变序列的倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体，最后用合适的载体克隆突变基因。
DNA shuffling技术
DNA shuffling是一种基于PCR技术的、新的体外定向分子进化技术。它利用DNasel将欲改造的基因或基因家族打断成一定的大小的片段,在PCR变性后的复性过程中,利用片段间具有的部分同源性发生错配。错配的片段互为模板进行延伸。而与此同时,不同来源的基因间也可发生重组,形成融合基因。经过反复的变性、复性(错配)和延伸(重组),直至扩出全长基因。这些基因在延伸中因为错配引入了突变,通过重组使基因融合,从而创造了新的基因。再通过人类的定向选择,最终可以得到一些符合人类需要的新基因。
在AAV定向进化中，例如上图所示，通过将多种AAV血清型的基因被扩增并以相同的比例混合在一起。然后通过瞬时DNase I处理将它们片段化。通过无引物PCR将小的DNA片段重新组装，并在该步骤中引入同源重组。这样，不同的AAV血清型在打断后重组，产生许多杂交血清型，并在体内模型中筛选出想要的血清型。
多肽插入技术
多肽插入技术是通过筛选出7到9个随机多肽序列插入到AAV衣壳蛋白序列的特定位点，以改造病毒，使得其能与特定细胞表面受体互相天然作用。
插入的多肽一般位于AAV衣壳暴露此段多肽的位置或者介导病毒与细胞相互作用的关键位置。
例如：英国格拉斯哥大学的一个团队就通过将使用噬菌体展示，在具有线性和环状文库的原代人隐静脉SMC上鉴定靶向配体，将线性肽EYHHYNK (EYH)和GETRAPL (GET)插入腺病毒和腺相关病毒2（AAV2）使得AD和AAV对血管平滑肌细胞(SMC)转导更显著且选择性增强。
目前随着大数据，人工智能等新技术的发展，构建AAV定向进化的血清型文库的技术正在与时俱进，期望逐步提升的技术能为AAV昂贵的前期研发成本减少负担，并同时最终使得接受AAV治疗的患者获益。
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参考来源：
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