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活体转染全攻略从DNA到小核酸到mRNA递送

Polyplus转染专家

2023-10-31

体内核酸递送的目的是在动物模型中进行体内基因功能研究，验证体外试验结果。用于治疗性目的体内核酸递送可用于基因治疗，癌症治疗以及疫苗的开发。在治疗中使用核酸的主要挑战在于将它们安全地递送到其预期的作用部位。

与质粒DNA相比，mRNA不需要递送到细胞核中，也没有插入诱变的风险。但同时由于mRNA亲水性强，容易被降解，mRNA递送也是一个难题。目前最常用的mRNA疫苗递送技术是脂质纳米粒（LNP），把mRNA包裹在脂质纳米颗粒里面，将其保护起来免于被降解。相对于其他递送系统，LNP有很多优势，比如包封效率高，细胞毒性和免疫原性低等。但目前的LNP靶向组织主要局限于肝脏，容易在肝脏中聚集。

作为递送领域的领导者和创新者，Polyplus在活体转染方面具有丰富的经验，其基于阳离子聚合物的转染试剂，天然的低毒高效和便利性使之成为从体外转染到体内核酸递送的理想工具。2001年推出的in vivo-jetPEI^®，已经有超过700篇参考文献，并被用作几个药物开发项目的递送载体。 新型阳离子脂质体in vivo-jetRNA^®+用于mRNA递送, 消除了LNPs靶向的局限型，它可以通过不同给药途径将mRNA递送到不同的细胞系和器官，确保在肝脏和肺以外靶器官的更好的生物分布。

最近，Polyplus 开发了新型阳离子脂质LipidBrick^® IM21.7C及其家族，用于改进LNP配方。概念验证已经表明，由于LipidBrick IM21.7c调节了LNP总电荷的内在特性，实现了更广泛的体内生物分布并减少了在肝脏中的积累。它提高了药物效率和制剂稳定性，扩大了LNP的应用范围，以满足不断增长的mRNA市场需求。

in vivo-jetPEI® 可递送任何类型的核酸

in vivo-jetPEI^®是最先进的活体转染试剂，可以安全有效地在任何动物模型中递送DNA, si/miRNA和其他类型的核酸。有超过700篇参考文献，可用于体内基因功能研究，癌症研究和免疫/疫苗。

多元化: 可用于任何动物模型和各种核酸类型

in vivo-jetPEI^® 可在任何器官或组织中，通过基因过表达或者基因抑制的方法进行基因功能研究。它可以在任何动物模型(mice, rat, guinea pig, dog, rabbit, monkey, etc...)中递送各种类型的核酸(plasmid DNA, siRNA, shRNA, miRNA and oligonucleotides)。已经有大量的文献证明了在不同动物模型中各类核酸的成功递送。

in vivo-jetPEI^® 可以通过全身和局部注射目标多种器官。注射途径在很大程度上决定了靶器官。例如，在静脉注射时， in vivo-jetPEI^®递送的 DNA 主要在肺部表达，也在肝脏、胰腺、肾脏、脾脏、膀胱、心脏和动脉中表达。而腹腔注射，基因在卵巢、胰腺、膈肌、子宫和胃中表达 (Fig. 1)。为了实现器官特异性基因表达，可以结合细胞特异性启动子和局部注射途径，达到在特定器官/组织中的基因表达。

Fig. 1: 小鼠中使用in vivo-jetPEI^®通过全身注射进行核酸递送的靶向器官

使用便捷：两步法操作

in vivo-jetPEI^®使用便捷，和体外转染类似，核酸和in vivo-jetPEI^®混合后，直接注射到动物体内(Fig. 2)。

Fig 2:in vivo-jetPEI^® protocol in mice

成功经验: 从基础研究到临床试验

由于其可靠性，安全性和递送效率，in vivo-jetPEI^®已经被用作几个药物开发项目的递送载体。正在进行的几项用于癌症治疗，疫苗和免疫的临床试验使用最高质量的GMP级 in vivo - jetPEI^®。

质量等级

in vivo-jetPEI^®有研发级用于基础研究和实验验证，PC级可用于临床前生物分布和毒理研究，GMP级 in vivo-jetPEI^®是最高质量等级的，符合人体临床试验的质量要求。

in vivo-jetRNA®+ 即用型试剂适用于任何动物模型的mRNA转染

高效的：100% 的mRNA包装能力，可媲美LNP递送效率
省时的：即用型试剂，不需要制剂设备
稳定的: 脂质体在不同 (低/高) mRNA浓度下保持稳定
通用的: 通过不同的给药途径目标任何靶器官/ 组织
安全的：保持动物和器官的健康

高效的: 100% 的mRNA包装能力，可媲美LNP递送效率

in vivo-jetRNA^®+是将mRNA递送至各器官的首选试剂。这是由其内在特性决定的： in vivo-jetRNA^®+能保护其有效荷载免受无处不在的核酸内切酶降解，防止与蛋白质的非特异性相互作用，并促进有效的进入细胞。

in vivo-jetRNA^®+表现出100%包裹mRNA的惊人能力（Fig. 1 A /），从而产生有效的基因表达，可与目前作为疫苗开发金标准的脂质纳米颗粒相媲美（Fig. 1 B /）。

Fig1.in vivo-jetRNA^®+可以100%包装mRNA带来高效的mRNA递送。A / 使用凝胶电泳(agarose gel)分析 mRNA alone (lane 1) 和完全被vivo-jetRNA^®+包裹的mRNA (lane 2) B/编码Luciferase的mRNA使用 in vivo-jetRNA^®+或Dlin-MC3-DMA LNP 通过iv注射进小鼠。注射后24小时分析Luciferase的表达。

稳定的: 脂质体在不同 (低/高) mRNA浓度下保持稳定

除了包裹mRNA的能力外，in vivo-jetRNA^®+还具有出色的稳定性。在室温或4°C，in vivo-jetRNA^®+脂质体的大小可以稳定长达一个月 (Fig 2. A/)。mRNA的浓度会影响脂质体的大小，但in vivo-jetRNA^®+ 在低浓度或高浓度mRNA下表现出了稳定的脂质体大小 (Fig 2. B/).

这使得in vivo-jetRNA^®+成为mRNA疫苗或肿瘤治疗的首选试剂。

Fig 2. 脂质体 (包含in vivo-jetRNA^®+和mRNA) 在低浓度和高浓度mRNA条件下都能保持长时间的稳定。A/ 50 μg/ml mRNA条件下，在室温或4°C储存15分钟, 1周，2周，3周和4周后脂质体大小。B/不同mRNA浓度下 ( 50, 100, 200 or 300 μg of mRNA/ml with a small mRNA (1929b)), 脂质体的大小。

通用的: 通过不同的给药途径目标任何靶器官/ 组织

给药途径的选择带来不同的mRNA生物分布。in vivo jetRNA^®+介导的mRNA递送可通过腹腔注射在多个器官中表达，特别是在免疫反应中起主要作用的脾脏和淋巴结中，但也在肺、肝、胰腺和子宫等其他器官中表达（Fig. 3）.

作为一种非病毒递送载体，in vivo jetRNA^®+可以安全地在动物中使用。不同于传统的疫苗方法，它是一类基于直接基因转移的新型疫苗。与病毒载体疫苗或抗原呈递细胞（APC）肽相比，它对接受者更安全，生产更快，更便宜，并且它具有巨大的潜力解决许多未满足的医疗需求。

Fig 3.通过不同给药途径，in vivo jetRNA^®+可以有效地将mRNA递送到不同的器官。编码荧光素酶的mRNA通过不同的给药途径A /腹腔（IP）和B /肌内注射（IM）使用in vivo jet RNA^®+注射到小鼠体内。24小时后检测荧光素酶的表达。

就安全性而言，in vivo-jetRNA^®+是最佳选择。注射后没有副作用，所有动物都保持健康，没有动物出现疼痛反应。通过任何给药途径递送mRNA – in vivo-jetRNA^®+脂质体后，靶向器官保持形态完整，没有观察到组织损伤。并且，使用 in vivo-jetRNA^®+不会触发促炎细胞因子表达。

基于脂质，in vivo-jetRNA^®+转染试剂是一个高效、稳定和安全的mRNA递送系统，可实现100% mRNA包装，媲美LNP 递送。即用型配方减少了制剂步骤，不需要制剂设备，in vivo-jetRNA^®+/ mRNA脂质体溶液只需两步制备。脂质体大小在不同mRNA浓度下（从低到高）保持稳定。它的应用包括预防性疫苗、mRNA治疗（癌症治疗、罕见疾病等）和基因编辑。独特之处是能够在各种模型中全通过身注射途径靶向多个器官，而非仅限于肝脏。

LipidBrick® IM21.7c & Family

作为递送领域的创新者，Polyplus开发了一系列用于LNP配方的阳离子，命名为LipidBrick^®。这些活性脂质保护mRNA分子，并在LNP的转染效率方面发挥重要作用。基于咪唑极性头，LipidBrick^®通过向LNP添加正电荷，在效力和靶向性方面拓宽了当前的应用范围：与基于可电离脂质的LNP相比，更多的mRNA被输送到肺和脾脏，同时减少肝脏中的积累。LipidBrick^®调整了LNP的整体电荷和生物分布。

Polyplus拥有LipidBrick^®的专利，以避免任何可能阻碍治疗进展的专利侵权。

概念验证显示了在mRNA-LNP中使用LipidBrick^® IM21.7c的潜力。

LNP 定性测试

使用编码荧光素酶的mRNA来测试几种LNP配方。Polyplus cLNP配方(包含LipidBrick^® IM21.7c) 的选择取决于三个参数：粒径，Zeta电位和包装效率（Fig. 1）。通过与使用Dlin-MC3-DMA（可电离脂质）的LNP相比, 调节活性脂质、结构脂质和调节组分之间的比例，Polyplus成功找到了一个具备可接受的纳米颗粒尺寸(<200 nm)、阳离子总电荷（约 20 mV）和 100% mRNA 封装效率的 LNP 配方。

Fig. 1：Polyplus cLNP特性。in vivo-jetRNA^®+使用推荐操作方法或者LNP在室温条件下和250μg/ml mRNA形成复合物一小时后的A/ 颗粒大小和B / Zeta电位。C /使用in vivo-jetRNA^®+或LNP包装mRNA（编码荧光素酶）的效率，使用RiboGreen试剂盒分析。

效率和生物分布

LNP特性会影响递送效率和器官的靶向性。通过修饰脂质结构（即脂质体或脂质纳米颗粒）和颗粒的总电荷，我们可以在小鼠中通过全身注射来调节核酸的生物分布（Fig. 2）。使用可电离脂质形成的LNP主要靶向肝脏，而使用阳离子脂质（LipidBrick^® IM21.7c）形成的LNP主要靶向肺和脾脏。

Fig. 2：含有LipidBrick^® IM21.7c形成的LNP通过IV注射将mRNA有效递送到不同的器官。 使用in vivo-jetRNA^®+或LNPs通过静脉注射（眼眶注射）将编码荧光素酶的mRNA注射到小鼠中。mRNA用量为7.5μg mRNA/小鼠。注射后24小时评估荧光素酶表达。

颗粒的稳定性对患者的安全和药物的有效性非常重要。Polyplus在CaCo-2细胞体外模型中测试了其LNP配方的稳定性，该研究表明，当LNP/mRNA储存在4°C时，LNP非常稳定并且表达良好。

在安全性评估中，我们发现Polyplus的 LNP配方与使用可电离脂质的LNP具有相似的细胞因子谱，没有或触发低的促炎反应。为了全面评估体内毒性的预测性生物标志物，该研究包括了与病理反应相关的血细胞因子。

了解更多关于LipidBrick^® IM21.7c，请阅读《新品到货丨LipidBrick® IM21.7c 新型阳离子脂质用于LNP配方》

Polyplus公司介绍

Sartorius旗下 Polyplus，是一家为先进生物制品、细胞和基因治疗生产提供上游解决方案的领先供应商，涵盖从研发到商业化的各个阶段。作为核酸递送的创新者，经典的产品组合是以工艺为中心的转染试剂、试剂盒和支持性服务，其中包括生物生产的行业标准，PEIpro^®和FectoVIR^®-AAV. 2022年整合了定制质粒载体设计作为公司扩展产品服务组合, 帮助行业优化工艺经济的第一步，同时满足严格的科学和法规标准。总部位于欧洲，在美国与亚洲地区均有业务，Polyplus持续推进其全球业务发展。