本文由鸣鹤私募医药研究员翻译编辑。
摘要：
小干扰RNA（siRNA）被视为一种有前景的治疗方法，用于治疗多种疾病。基于siRNA的治疗方法通过在转录后水平上（Post-transcriptional level，指的是mRNA形成之后到其被翻译成蛋白质之前的调控阶段。）选择性地靶向并沉默致病基因，提供了一种独特的作用机制。本文概述了当前siRNA治疗的研究现状，重点介绍了其在不同治疗领域中的潜力。本综述的第一部分介绍了siRNA技术的基本原理，包括其作用机制和递送方式。随后，我们讨论了与siRNA递送和制造开发相关的障碍，以及克服这些障碍的策略。总结了siRNA治疗在癌症、遗传性疾病、病毒感染和炎症性疾病等多个疾病领域的临床进展。最后，我们总结了siRNA研发过程中的成功经验、失败教训和获得的启示。随着递送系统的进步和靶点选择的改进，医学领域有望实现变革，siRNA治疗有望为患者提供新的治疗选择。
关键词：siRNA治疗；临床试验；疾病；三聚GalNAc缀合物；siRNA；基因治疗
1. 引言
由于其选择性沉默致病基因的高特异性和高效性，siRNA长期以来被视为一种有潜力的治疗方式。这与小分子药物形成鲜明对比，后者只能靶向约15%的基因 [1–3]。RNA干扰（RNAi）是一种细胞中自然存在的生物过程，可在转录后水平抑制基因表达。安德鲁·费尔和克雷格·梅洛在1990年代末发现了RNA干扰机制，开启了对细胞基因调控机制的新认识 [4]，也为开发RNA类治疗手段提供了契机。然而，siRNA的应用最初受到限制，因为不同长度的双链RNA（dsRNA）会激活干扰素反应，从而导致mRNA水平的非特异性下降。为了解决这一问题，研究人员发现带有两个核苷酸3′突出端的dsRNA片段可以高效降解序列特异性的mRNA [5,6]。这些小干扰RNA通常是双链RNA分子，长度为21–23个核苷酸，设计用于与目标mRNA序列互补 [7–10]。因此，这些siRNA可以在不引发干扰素产生的情况下，阻碍哺乳动物细胞中目标基因的表达。siRNA药物作为分子生物学和基因调控领域的一类新兴治疗物质，显示出良好前景。这些小RNA分子可以与信使RNA（mRNA）结合，干扰其翻译为蛋白质，或诱导其降解，从而调控基因表达 [11–14]。受到RNA干扰治疗潜力的启发，研究人员开始开发利用该机制实现靶向基因沉默的方法。siRNA药物的设计目标是通过将合成的siRNA分子引入细胞内，专门沉默致病基因。siRNA进入细胞后，引发一系列酶促反应，形成RNA诱导沉默复合体（RISC）。RISC与目标mRNA结合并引导其降解，从而阻止相应蛋白质的产生 [15,16]。此外，siRNA治疗有望解决一些传统上难以治疗的疾病 [17,18]。这为治疗遗传性疾病以及多种癌症、病毒感染、炎症性疾病和神经退行性疾病打开了新路径。siRNA也可在研究中用于研究基因功能 [19–22]。
在实际应用中，还涉及药物递送和制造问题。将药物送达目标部位并达到所需浓度本身就是一项艰巨任务。siRNA因其特性，面临的挑战更大。siRNA药物的开发主要面临递送方式方面的挑战。高效的递送和细胞摄取对于治疗成功至关重要。为增强siRNA的稳定性、细胞摄取能力和靶向特异性，研究人员探索了多种递送载体，如脂质纳米颗粒、病毒载体和缀合分子。
尽管存在这些挑战，一些siRNA药物已获得批准，我们开始逐渐了解这一治疗方式适合哪些疾病、不适合哪些疾病。持续的研究正不断挖掘siRNA药物的治疗潜力，旨在提高其特异性、稳定性、递送效率和安全性。此外，许多递送系统已被开发并取得了可喜成果，例如局部药物释放系统（LODER™）聚合物、靶向RNAi分子（TRiM™）、脂质纳米颗粒（LNPs）、动态多缀合体（DPC™）、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）siRNA缀合物、外泌体和多肽纳米颗粒（PNPs）。2018年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了首个RNAi类治疗药物Onpattro（patisiran），用于治疗一种罕见的遗传性疾病——家族性转甲状腺素蛋白淀粉样变性。这一批准是药物研发领域的一个重要里程碑，凸显了其在治疗遗传病方面的潜力。因此，在本综述中，我们将讨论（i）siRNA的作用机制，（ii）siRNA面临的挑战及应对策略，（iii）制造方面的挑战，（iv）裸siRNA、脂质纳米颗粒（LNPs）和GalNAc–siRNA缀合治疗剂，（v）siRNA开发过程中的成功、失败和经验教训。可以得出结论，siRNA药物的发展对于个性化医疗和靶向治疗具有重要意义，并将为多种疾病提供新的治疗方案。
2. RNA干扰的作用机制
RNA干扰是一种天然的细胞过程，能靶向并降解mRNA，从而实现基因表达的沉默。该机制在基因调控以及抵御病毒入侵的先天免疫中发挥着关键作用。如前所述，siRNA作为21–23个核苷酸长的双链RNA分子，其作用在转录后阶段发挥。RNA干扰的第一步是识别并切割长双链RNA。Dicer酶能识别并结合合成siRNA或前体miRNA等长双链RNA分子。siRNA双链结构由乘客链（正义链）和向导链（反义链）组成。下一步为加载入RISC复合体（见图1），即Dicer处理后的siRNA片段被加载进RISC复合物中。在RISC复合物中，siRNA链会被分离，具有更稳定5′末端的那条链通常被整合进活性的RISC复合体中。RISC复合物中AGO2核酸酶成分会切割siRNA的乘客链（正义链），导致双链解旋并降解乘客链。相反，向导链（反义链）仍与RISC结合。
图1. RNAi的基因沉默机制。Dicer从dsRNA中生成siRNA后，由RISC加载。AGO2酶将siRNA的乘客链与向导链分离。随后RISC通过向导链与目标mRNA结合，从而通过siRNA与目标mRNA的互补结合引发mRNA的切割。图标由Biorender.com制作。
最后是mRNA靶向识别；siRNA载入的RISC复合物会扫描细胞内的mRNA分子，以寻找与siRNA导链互补的靶mRNA。一旦找到互补的靶mRNA，RISC复合物就会在特定位置诱导该mRNA的切割，从而导致其降解并抑制基因表达[9]。事实上，有研究报告指出，长度超过30个核苷酸的长双链RNA分子（包括某些siRNA）可在哺乳动物细胞中诱发先天性免疫反应，从而引发干扰素的生成。这种反应是细胞对病毒感染的防御机制的一部分，因为病毒在其复制过程中常常产生长双链RNA分子。此外，在设计用于实验或治疗应用的siRNA时，必须确定能够有效诱导基因沉默的最低浓度[23]，并将其长度保持在最佳范围内，以避免触发不必要的免疫反应。
3. 挑战与解决之道
siRNA已成为治疗应用领域中一个极具前景的工具。这种小型双链RNA分子可以沉默特定基因，提供治疗多种疾病的潜在手段。尽管siRNA技术相较于传统小分子药物具有许多优势，但仍需解决一些挑战，例如递送效率、稳定性、免疫刺激以及潜在的脱靶效应（见图2）。当前的研究与开发工作正致力于克服这些挑战，以充分发挥siRNA技术在治疗各种疾病中的潜力。通过持续的研究和技术进步，siRNA治疗在多种疾病条件下的成功应用将得以实现。
3.1. siRNA的递送
RNA干扰技术在治疗应用中的主要挑战是其递送方式。siRNA必须在不被清除或降解的情况下穿过体内环境，才能在目标细胞的胞质中发挥作用。siRNA的安全性与高效递送在某种程度上取决于其能否成功进入目标器官或组织。siRNA疗法成功到达特定靶点（局部递送）的能力将有助于提高药物的生物利用度。在过去几十年里，各种非病毒载体已被报道，并日益受到关注，作为可靠且有效的siRNA递送方式，例如物理方法[24–30]。此外，许多研究人员还探索了聚合物（包括蛋白质和肽类）作为siRNA的递送载体[30]。siRNA在系统给药中面临的挑战包括生物利用度差、迅速排泄、系统毒性以及无法有效靶向受影响器官或细胞类型[31,32]。众多研究已经考察了各种局部递送治疗性siRNA的方法。这种递送途径因所需剂量更低、副作用更小而变得更加可取和实际。为克服这一挑战的策略包括使用病毒载体、脂质纳米颗粒、化学修饰，或利用三聚GalNAc偶联物精确将寡核苷酸递送至肝细胞，这一策略已成为治疗性寡核苷酸领域的重要进展[33–36]。
3.2. 脱靶效应
尽管已经付出努力以将siRNA递送至特定靶点，研究仍显示siRNA可能通过沉默非目标基因而产生脱靶效应。先天性免疫反应可通过转录后基因抑制产生脱靶效应，但被认为潜在的贡献者是siRNA诱导的类miRNA效应[37]。这种类miRNA效应可能通过两种替代机制介导：一种是siRNA对内源性miRNA机制的广泛接触[38]，另一种是通过与不需要的转录本3′UTR区的部分序列互补性实现的序列依赖性调控[39]。脱靶效应与体内RNAi相关，会带来意想不到的生物学后果，从而使得解释siRNA的治疗效果变得困难，并危及RNAi治疗的安全性。当前的努力正集中在设计和筛选高度特异性的siRNA分子，以最小化脱靶效应。克服脱靶效应的关键在于对位于种子区周围的核苷酸进行化学修饰。例如，在种子区的特定位点引入2′-O-甲基（2′-O-Me）修饰就足以抑制并消除siRNA的脱靶作用，同时不会显著损害对预定靶点的沉默作用[40,41]。通过用修饰过的2′-Ome、2′-氟（2′-F）以及2′-脱氧类似物替代尿苷，可以降低siRNA诱导的免疫应答的发生。这些改变已被证明可以阻止TLRs对siRNA的识别[42]。
3.3. 生物稳定性
延长siRNA半衰期而不危及其生物活性的化学修饰已被研究作为将siRNA转化为增强型药物的方法。提高核酸酶稳定性对于暴露在富含核酸酶的环境（如血液）中的siRNA双链体至关重要[43,44]。此外，当将siRNA直接递送到核酸酶含量较低的部位时，例如通过与脂质体等运输载体或肺等器官的联合分布，其对核酸酶稳定性的要求可以显著降低[45]。引入不同的化学改性可望提升siRNA对核酸酶的稳定性。为保持siRNA在进行这些修饰过程中的切割活性，必须保留反义链5′末端的磷酸基或游离羟基[42]。通过将RNA链3′端连接处的磷酸二酯官能团替换为磷代硫酸酯（PS），可削弱其对外切核酸酶的敏感性，从而抑制酶促降解、实现对核酸酶的抵抗[46]。
此外，通过改变核糖2′位上的基团，可以显著提高siRNA的稳定性，降低其核苷酸间磷酸键被核酸酶切割的敏感性，并延长其半衰期。引入锁核酸（LNA）可大幅提升siRNA的半衰期，其作用机制包括增强核酸酶稳定性与稳定双链结构[47]。确保siRNA在递送过程及其进入细胞后的稳定性和保护性，对其治疗效果至关重要。当前，正在探索多种化学修饰或包封策略以提升其稳定性。与此同时，已有众多关于siRNA分子化学修饰的研究被发表[48–51]，并已在表1中进行了总结。
3.4. 免疫原性
小干扰RNA（siRNA）分子可能会在体内引发免疫反应。这是因为免疫系统会将双链RNA（如siRNA）识别为病毒感染的信号。免疫反应可能会激活多种免疫细胞，释放炎症介质，并产生细胞因子。siRNA的免疫原性可能带来多个影响。首先，它可能导致不良结果和患者不良反应，如类流感症状、发热或输注相关反应。这些免疫反应会限制siRNA治疗的耐受性和安全性。其次，免疫反应可能降低siRNA分子的治疗效果。免疫系统的激活可能会导致siRNA分子的快速降解或清除，从而降低其在靶细胞或组织中的浓度和作用时间。此外，免疫反应还可能触发干扰素的产生，从而干扰RNA干扰通路并削弱基因沉默效果。为了应对免疫原性的挑战，研究人员正在采用多种策略。一种方法是通过设计具有特定结构修饰的siRNA分子以减少免疫激活。例如，对siRNA的糖环或碱基进行特定的化学修饰可以增强其稳定性并最小化免疫识别。另一种方法是开发适当的递送系统，以屏蔽siRNA分子免受免疫系统的识别。多种基于纳米粒子的递送系统，例如脂质纳米粒子或基于聚合物（合成或天然）的载体，可以保护siRNA免于降解，并减少其被免疫系统识别的可能性。此外，细致地选择和设计siRNA序列也有助于降低其免疫原性。通过广泛的筛选和优化流程，可以识别出较不容易激发免疫反应的siRNA分子。解决siRNA分子的免疫原性问题至关重要，因为这将提高其临床应用的成功率。因此，研究人员致力于改善siRNA的安全性、有效性和治疗潜力，以最小化免疫激活并增强其稳定性。
3.5. 组织穿透力有限
siRNA在穿透特定组织或屏障（如血脑屏障）方面常常面临挑战。显而易见，siRNA是体积较大且带负电荷的分子，这些特性使其难以高效穿越生物屏障并到达特定组织的靶细胞。应当理解，组织穿透程度受到多个因素的影响，如给药途径、所使用的递送系统以及所靶向的具体组织或器官。例如，肝脏和肾脏在全身给药后通常会富集siRNA，因为这些器官对核酸具有较高的摄取能力。然而，大脑、心脏或肺等其他组织对siRNA的摄取则可能较为有限。为克服这一挑战，研究人员正在开发多种策略以增强siRNA的组织穿透能力。一种方法是使用靶向递送系统，包括在纳米粒子表面进行修饰，使其能够特异性识别并结合靶细胞上的受体或分子片段，从而实现高效摄取。这可以改善siRNA向特定组织或细胞类型的运输。另一种策略是利用物理手段增强组织穿透力。例如，电脉冲转染（electroporation）通过施加电脉冲来增强细胞膜的通透性，使siRNA能更高效地进入靶细胞。同样，超声波介导的递送技术利用声波暂时破坏细胞膜，促进siRNA的摄取。通过对siRNA进行化学修饰也可以帮助提高其组织穿透性。特定的结构改造可增强稳定性、减少降解并改善细胞摄取。例如，脂质缀合或基于脂质的制剂能够改善siRNA的递送并促进其穿透组织。此外，研究人员还在探索外泌体或细胞穿透肽等先进的载体系统，以增强siRNA的递送并改善组织穿透能力。这些载体可以高效地将siRNA跨越生物屏障并促进其被靶细胞摄取。虽然组织穿透力有限是siRNA治疗面临的关键挑战，但在靶向递送系统、物理手段、化学修饰和载体系统等方面的持续研究和进展，为增强siRNA的组织穿透力和改善治疗效果提供了有前景的解决方案。
3.6. DNA与RNA修饰
RNA修饰在调控基因表达中发挥着重要作用，并可显著影响siRNA的稳定性、特异性和治疗效果。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是最常见的mRNA内部修饰，它对RNA代谢过程具有调控功能，具体包括降解、翻译、稳定性和输出，从而介导多种生理和病理过程的结果，包括应激适应、免疫调控、发育程序化和肿瘤发生。该修饰可能通过改变靶mRNA的可及性或稳定性来影响siRNA介导的基因沉默。同样，RNA中的5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）修饰也会影响其结构和功能，进而可能影响siRNA的结合和效果。研究表明，m6A和m5C之间存在调控上的交叉作用，即其中一个的变化可能会影响另一个，从而对siRNA活性产生复合性的间接影响。优化siRNA治疗策略需要考虑DNA与RNA修饰之间的相互作用。RNA修饰的测序和计算分析方面的突破为提升siRNA效果提供了路径。这些方法可以预测靶mRNA上的修饰位点，从而实现精确的siRNA定位，并最小化脱靶效应。此外，揭示RNA修饰在不同细胞环境中的动态分布对于制定策略以改善siRNA稳定性和递送至关重要。随着我们对RNA修饰理解的加深，siRNA设计原则也将不断演进，使得能够开发出更为复杂和疾病特异性的RNA干扰疗法，为癌症和心血管疾病的治疗开辟新途径。
4. siRNA的制造挑战
siRNA的制造过程通常涉及化学合成，包括固相或酶促方法。siRNA治疗药物的大规模生产和制造可能较为复杂且成本高昂。开发高效且具有成本效益的制造工艺将使siRNA治疗药物更容易为患者所获得。固相合成是最常用的方法，它涉及将核苷酸依次添加到固定在固相载体上的生长链上 [89–91]。该过程可以实现自动化，并允许高通量合成siRNA。酶促方法（如体外转录）也可用于生产siRNA，尽管其使用频率较低 [92,93]。值得注意的是，siRNA制造成本可能受多种因素影响，如生产规模、纯度与质量要求，以及所需的额外修饰或缀合。大规模合成有助于通过规模经济降低成本。此外，合成技术与工艺的进步近年来提高了效率并降低了siRNA的生产成本（见图3）。然而，尽管取得了这些进展，与其他替代疗法相比，siRNA的制造成本仍然相对较高。这主要归因于所涉及的复杂且精密的合成过程、对高纯度和质量控制的需求以及原材料的成本。例如，patisiran、givosiran、lumasiran、vutrisiran和nedosiran等用于罕见遗传病的药物，其年治疗费用大致为40万美元至164万美元不等 [94–98]。虽然其他替代疗法可能具有较低的直接药物成本，但它们通常涉及复杂且昂贵的手术程序（如器官移植）或需要长期的专业护理与管理。用于高胆固醇治疗的Inclisiran是一个值得注意的例外，其年成本仅约为3250美元，可与其他降脂药物竞争。尽管siRNA的制造成本相对较高，但技术进步和优化策略为降低费用、提高可及性与可负担性提供了机会。
以下是一些关键考虑因素：
质量控制与保障：siRNA治疗的安全性与有效性依赖于在整个生产过程中维持严格的质量控制与保障标准，主要是由于这些分子及其递送系统的复杂特性 [99]。这包括对siRNA产品进行严格测试与表征，以确保其纯度、稳定性以及内毒素水平的合适性。实施全面的质量管理体系并遵守良好生产规范（GMP）对于确保产品质量、一致性和可靠性至关重要。
稳定性与储存的考量：siRNA分子可能易受到变化和降解的影响，从而降低其效力 [100]。用于siRNA的纳米颗粒递送系统开发本身也存在制造挑战。这些纳米载体必须以一致的大小、形状和表面区域修饰进行生产，以确保可重复的药代动力学与组织分布 [101]。此外，还需进行稳定性研究，以确定siRNA治疗药物的理想储存条件和保质期。可能需要采用冷冻干燥或将siRNA分子封装在稳定化学物质中，以提高其在储存和运输过程中的稳定性。
递送系统质量的保障：递送系统除了需满足将siRNA分子转运至目标细胞或组织的要求外，还必须遵循特定的质量标准。为确保递送系统适用于siRNA治疗药物，制造商必须证明这些系统的安全性、有效性和稳定性，并进行严格的风险分析。
成本考量：规模化和成本效益对于siRNA治疗药物的广泛应用至关重要。制造商必须开发高效的生产流程，并在不影响质量与安全的前提下优化成本。
产业、学术界与监管机构之间的合作对创造有利的监管环境、建立清晰的制造流程、质量控制与产品评估指南至关重要，以确保siRNA治疗药物的安全有效使用。siRNA治疗药物的前景令人振奋，具有推动医学领域发展的巨大潜力。
siRNA治疗的主要障碍之一是能否将其高效且有针对性地递送至目标细胞或组织。当前的研究聚焦于开发改进的递送载体，例如脂质纳米颗粒、病毒载体、外泌体以及基于缀合物的方法。递送系统的改进将增强siRNA的稳定性，提高细胞摄取效率，并加强对特定组织的靶向能力。值得一提的是，识别适用于siRNA治疗的正确靶点至关重要，这可能涉及使用先进的基因组学、蛋白质组学和计算方法来识别具有高治疗潜力的疾病特异性靶点。此外，将siRNA治疗与其他治疗手段如小分子药物、抗体或免疫检查点抑制剂相结合，有望产生协同效应并改善治疗效果。组合疗法可能增强治疗效力、克服耐药性并提供个性化治疗方案。此外，siRNA治疗还可与CRISPR-Cas9等基因编辑技术结合，以实现对基因组的精确修饰 [102]。siRNA治疗药物的前景令人振奋，当前在递送系统、靶点选择、联合疗法以及制造流程等方面的研究持续推进。上述领域的进展有望促使多种疾病的安全有效治疗方案问世，为患者提供新选择，并有望重塑现代医学格局。未来的关注点应放在递送载荷的优化和以患者为中心的最佳给药途径上。
（未完待续）