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深度解读
在昨天开启的“探秘LNP之‘出芽’”系列中，我们看到外部环境（冻融）与特定缓冲液的组合可以诱导LNP表面“出芽”。但这不禁让我们思考：这种结构的形成，仅仅是外界压力所致吗？还是说，这种趋势早已“写”在了LNP的基因里？今天，我们将深入LNP的“内核”，探索一个更根本的原因——组成LNP的脂质分子本身，是如何因“性格不合”而在内部上演“博弈”，最终导致“出芽”的出现。今天, 我们聚焦一篇发表于《The Journal of Physical Chemistry B》的重磅研究, 由脂质纳米粒(LNP)领域的先驱、英属哥伦比亚大学的 Pieter R. Cullis 教授团队带来的：“Microfluidic Mixing: A General Method for Encapsulating Macromolecules in Lipid Nanoparticle Systems”。
这项研究如同一部高分辨率的纪录片，带领我们深入LNP的纳米级内核，揭示了其内部结构的惊人可塑性。它解决了LNP领域一个长期存在的“黑匣子”问题：我们每天都在谈论LNP如何递送mRNA，但其内部究竟长什么样？不同“配方”的脂质又是如何协同工作来包裹大小各异的药物分子的？研究团队另辟蹊径，通过系统地调整LNP的脂质配方，并结合先进的冷冻透射电镜（Cryo-TEM）技术进行“现场直播”，发现LNP的内部结构并非一成不变。最令人称奇的是，当LNP包裹mRNA或质粒DNA等“大块头”分子时，其表面会鼓出一个个奇特的“出芽”（Blebs）。而这一现象的“开关”，竟掌握在一种名为DSPC的辅助脂质手中。这一发现不仅为我们提供了前所未有的视角来理解LNP的自组装机制，更为未来如何“量体裁衣”，设计出更高效、更稳定的新一代基因药物递送载体，提供了宝贵的路线图。
图1. 配方决定命运：LNP内核从“实心球”到“千层饼”的演变
在LNP的“四人组”配方中，可电离阳离子脂质是负责与带负电的核酸（如siRNA、mRNA）结合的“主力军”。我们通常认为，阳离子脂质的比例越高，包裹效率应该越好。但实验结果却给出了一个意外的答案：如上图A所示，当阳离子脂质（DLin-KC2-DMA）的摩尔比例从50%增加到70%时，包裹效率尚可维持，可一旦飙升至80%，包裹效率便出现了断崖式下跌（实线）。这说明，LNP的构建并非简单地“多多益善”。
然而，转机出现在对辅助脂质的选择上。配方中除了阳离子脂质，还有扮演“骨架”角色的磷脂，如DSPC或DOPE。DSPC分子结构规整，像一块块“积木”，倾向于形成稳定的双层膜结构（也就是“千层饼”的夹层）。而DOPE分子则呈“锥形”，更喜欢挤在一起形成紧密的胶束结构（也就是“实心球”的内核）。研究人员将配方中的DSPC替换为DOPE后（虚线），奇迹发生了：即便在80%的超高阳离子脂质比例下，siRNA的包裹效率依然能维持在高位。这一结果首次揭示了辅助脂质在维持LNP结构和功能上的关键作用：DOPE的“锥形”结构能更好地适应和稳定由阳离子脂质与核酸形成的内核，避免了在高比例下结构的崩溃。
图2. 核心发现：“出芽”的出现与消失，DSPC与DOPE的结构之争
如果说包裹小小的siRNA只是“初级考验”，那么递送尺寸大上百倍的mRNA或质粒DNA则是对LNP结构稳定性的“终极压力测试”。正是在这个环节，研究团队捕捉到了前文提到的“出芽”（Blebs）现象。
上图的冷冻电镜照片清晰地展示了这一核心发现。当LNP配方中使用DSPC作为辅助脂质来包裹质粒DNA（图A）或mRNA（图E）时，可以看到许多LNP不再是完美球形，其表面明显突出一个或多个小“出芽”，如同细胞在压力下产生的“出芽”。这些“出芽”内部的电子密度较低，暗示着它可能是一个充满水的、由双层膜构成的独立区域。然而，当研究人员保持其他所有成分不变，仅仅将DSPC替换为DOPE后（图B、D、F、H），所有的“出芽”都神秘地消失了，LNP恢复了光滑、致密的球形结构。
这一鲜明对比有力地支持了一个关键假说： 倾向于形成平整双层膜的DSPC，与由阳离子脂质和庞大核酸分子形成的弯曲、紧凑的内核“性格不合”。在包裹大尺寸核酸的巨大压力下，DSPC被从内核中“排挤”出来，不得不在LNP表面“另立门户”，形成了充满水的层状“出芽”。而DOPE凭借其天然的“锥形”结构，能完美地融入并稳定这个高度弯曲的内核，从而形成一个均一、完整的纳米颗粒。正如原文强调的，“用DOPE替换DSPC后‘出芽’的消失，为这一假说提供了强有力的支持”。
图3. “黑加仑面包”模型：金纳米粒让LNP内核结构无所遁形
为了进一步验证他们的假说，并更直观地展示LNP的内核，研究团队进行了一个巧妙的实验：用带负电的金纳米粒（Au-NP）来模拟核酸，并将其包裹进LNP中。由于金的原子量极大，在电镜下会呈现出极高的电子密度，如同黑夜中的繁星，让内核结构一目了然。
结果令人震撼。如图A所示，当使用DSPC配方时，金纳米粒被包裹在LNP内部，形成了酷似“黑加仑面包”（currant bun）的结构。金纳米粒（黑加仑）随机分布在由脂质构成的基质（面包）中。值得注意的是，这些LNP的表面再次出现了熟悉的“出芽”结构。而当我们再次切换到DOPE配方时（图B），“出芽”毫无悬念地消失了，LNP呈现出更大、更均一的球形，内部容纳了更多的金纳米粒。这个“黑加仑面包”模型直观地证明了LNP的内核是一个由阳离子脂质、辅助脂质和药物分子共同构成的、高度融合的纳米结构复合体，而非简单的“核-壳”模型。DSPC配方下“出芽”的再次出现，进一步证实了其在包裹大尺寸/高密度客体时容易发生相分离的特性。
他山之石，可以攻玉
这项发表于2015年的研究，如今看来依然闪烁着智慧的光芒，它为我们理解和设计LNP提供了三层深刻的启示：
1.提炼核心科学思想： LNP的设计哲学核心在于“形状匹配”与“相容性”。其内部并非铁板一块，而是一个动态的、由不同形状偏好的脂质分子相互博弈、最终自组装形成的复杂纳米结构。像DSPC这类“喜好平直”的脂质与DOPE这类“喜好弯曲”的脂质，在包裹不同尺寸和形态的药物时，会展现出截然不同的行为。理解并利用这种分子几何学的原理，是实现LNP理性设计的基石。
2.提供背景与横向对比： 在这篇论文发表之时，LNP用于siRNA递送已取得巨大成功，但其作为通用平台包裹更大分子的潜力与机理尚不清晰。Pieter Cullis团队的这项工作，承前启后，不仅将微流控这一可规模化的生产技术应用于LNP的系统性研究，更重要的是，它通过精妙的实验设计和直观的Cryo-TEM成像，将LNP内部的“黑匣子”彻底打开。它解释了为什么某些早期基于DSPC的LNP配方在递送大分子时效率不彰，并指明了DOPE这类非双层膜脂质（non-bilayer lipids）在稳定LNP内核、提升包裹效率上的巨大价值。这为后来辉瑞/BioNTech和Moderna的mRNA疫苗所采用的LNP配方提供了重要的理论基础。
3.提出深刻见解与未来展望： 这项研究揭示的“出芽”现象，与其说是一个“缺陷”，不如说是一个可供利用的“特征”。这启发我们思考：我们能否主动设计具有特定“出芽”或多区域结构的LNP？例如，将亲水的药物装载于“出芽”中，将疏水的药物或mRNA包裹在内核里，从而实现一种LNP递送多种药物的“鸡尾酒疗法”。此外，既然我们知道了DSPC与DOPE是调控LNP结构的关键“旋钮”，那么未来在递送更大更复杂的基因编辑工具（如CRISPR系统）时，我们就可以更精准地调节“旋钮”，定制出兼具高包裹率和高稳定性的递送载体，将基因疗法的潜力推向新的高度。
参考文献
Leung AK, Tam YY, Chen S, Hafez IM, Cullis PR. Microfluidic Mixing: A General Method for Encapsulating Macromolecules in Lipid Nanoparticle Systems. J Phys Chem B. 2015 Jul 16;119(28):8698-706. doi: 10.1021/acs.jpcb.5b02891. Epub 2015 Jul 7. PMID: 26087393.
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