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深度解读
在本系列的前几篇文章中，我们已深入探讨了缓冲液浓度、LNP结构、以及两种关键的化学降解机理。今天，作为本系列的收官之作，我们将通过这篇重磅研究，把所有这些“细节”整合升华，从一个“过程即设计”的系统视角，来审视LNP制备的全流程，看清每一个工艺步骤是如何环环相扣，共同谱写出mRNA药物的最终命运。由上海交通大学医学院附属仁济医院的杨泰华、万平、夏强团队与合作者带来的：“Influence of salt solution on the physicochemical properties...”。发表于《Journal of Nanobiotechnology》的重磅研究
这项研究看似在探讨一个“平平无奇”的工艺问题——制备过程中的盐溶液，但它却揭示了一个足以影响整个mRNA药物行业的“卡脖子”细节。长久以来，全球的科学家们将目光聚焦于LNP的“核心原料”——可电离脂质的设计，却往往忽略了那些看似简单的“汤料”（缓冲盐溶液）。本文系统性地证明，正是这些“汤料”的微妙差异（如pH值、盐浓度和种类），在LNP从诞生到储存的每一步中，都扮演着决定其封装效率、稳定性、乃至最终在体内靶向何方和药效强弱的“幕后推手”角色。这项工作将LNP的制备从一门“玄学”手艺，转变为一门可预测、可优化的精密科学，为开发更高效、更稳定的mRNA药物提供了清晰的路线图。
图1. 源头把控：mRNA“溶解液”的pH值是封装效率的关键
LNP的制备过程好比“包饺子”，mRNA是“馅”，脂质是“皮”。第一步，如何处理“馅料”至关重要。研究团队首先探究了用于溶解mRNA的起始水溶液（mRNA aqueous solution）的影响。他们发现，在所有变量（盐种类、浓度、pH）中，pH值是绝对的核心。
如上图所示，当溶液的pH值设定在酸性的4.0时，LNP的各项理化性质表现最佳。这背后的科学原理非常巧妙：在酸性条件下，LNP中的可电离脂质会带上正电荷，而mRNA分子链本身带负电荷，两者之间强烈的静电吸引力使得“皮”能紧紧地、高效地将“馅”包裹起来。这直接带来了两个关键优势：
高封装率（EE）：更多的mRNA被成功装载进纳米颗粒中，减少了药物浪费。
均一的理化性质：形成的LNP粒径更小、更均匀，这对于药物在体内的递送和细胞摄取至关重要。
实验结果清晰地表明，与pH为6的溶液相比，使用pH为4的溶液制备的LNP，在细胞中的蛋白表达水平高出近3倍。这证实了从源头控制pH值，是确保LNP“先天优良”的第一步。
图2. “洗涤”的艺术：交换缓冲液的pH竟是调控LNP体内靶向的“隐形之手”
LNP在混合成型后，需要一个“纯化”或“洗涤”的步骤，即用新的缓冲液（exchange solution）替换掉原来的反应液。传统观念认为这只是一个简单的纯化步骤，但本研究发现，这一步的pH值，竟能不可思议地调控LNP最终在体内的分布！
研究团队发现，在最终存入中性的PBS储存液之前，所使用的交换缓冲液的pH值，对LNP在小鼠体内的表达行为有巨大影响。具体来说，使用pH值更高、更接近中性的交换缓冲液处理的LNP，其在肝脏的蛋白表达水平显著高于经过酸性缓冲液处理的组别。如上图原文图6C所示，无论是在静脉注射（i.v.）还是肌肉注射（i.m.）后，交换液的pH值都与最终的肝脏表达量呈现出显著的正相关性。
这是一个极其重要的发现。它意味着，我们仅仅通过调整生产中一个中间步骤的缓冲液pH，就可以像一个“隐形的开关”一样，引导药物更多地去往肝脏，这对于肝脏靶向的mRNA疗法（如治疗肝脏遗传病、肝癌等）的开发具有巨大的指导意义。
图3. “保鲜”的秘诀：蔗糖是确保LNP冻融稳定的“定海神针”
mRNA药物非常娇贵，通常需要-20°C甚至更低的温度下冷冻运输和储存。然而，“冷冻-解冻”这个过程对于纳米颗粒来说是一次严峻的考验，极易导致颗粒聚集变大、药物泄漏，最终导致失效。如何让LNP安然度过“冻融”考验？答案就在于最终的储存液（storage solution）。
研究团队的系统性研究明确指出，蔗糖是维持LNP冻融稳定性的关键保护剂。如上图所示，不含蔗糖的LNP在经历一次冻融循环后，粒径暴增了近300%，封装率也大幅下降。而当在储存液中加入了300mM的蔗糖后，LNP的粒径和封装率在冻融前后几乎没有变化，其在细胞中的基因表达活性也得到了完美的“保鲜”。
蔗糖作为一种经典的冷冻保护剂，其分子可以与LNP表面形成氢键，在冷冻过程中替代水分子，形成一层“玻璃态”的保护层，从而防止冰晶的形成和对LNP结构的破坏。这一发现为mRNA疫苗和药物的制剂开发提供了金标准，即300mM蔗糖是确保产品货架期和稳定性的“定海神针”。
图4. 眼见为实：不同“配方”塑造迥异的LNP微观结构
前面的数据已经证明了不同溶液配方对LNP性能的巨大影响，但这些影响是否能在微观世界留下痕迹？研究人员利用冷冻透射电镜（cryo-TEM）技术，让我们得以“眼见为实”。
结果令人震惊。上图清晰地展示了，即使使用完全相同的脂质原料，仅仅因为制备溶液的不同，最终得到的LNP在形态上竟有天壤之别：
对照组（Control）：使用常规但未经优化的溶液制备，LNP形态不均一，其中近10%的颗粒出现了“出芽”（Bleb）的异常结构。
E1组：出现了大量直径小于30纳米的“空壳”LNP，这无疑会影响药物的有效剂量。
E7组：超过50%的颗粒都携带了“出芽”结构，形态极差。
E15组（最优组之一）：展现了近乎完美的形态——颗粒大小均一，呈饱满的球形，几乎没有异常结构。
这张图有力地证明了，LNP的制备过程本身就是产品设计的一部分。不同的“汤料”和“烹饪手法”，会直接塑造出结构和质量截然不同的最终产品。这解释了为什么看似微小的工艺参数变化，会对最终的药效产生如此巨大的影响。
他山之石，可以攻玉
1. 提炼核心科学思想： 这篇研究的核心设计哲学是“过程即设计”（Process is the Design）。它将研究的焦点从单一的“材料创新”（设计新脂质）拓展到了“工艺工程”（优化制备流程）的维度。研究者通过系统性的多变量分析，将一个复杂的、经验主义的制备过程，分解为可量化、可预测的科学参数，为mRNA药物的CMC（化学、制造和控制）研究树立了典范。
2. 背景与横向对比： 在过去的LNP研究中，大部分文献的“材料与方法”部分对制备溶液的描述都极其简化（例如，“溶解于10mM柠檬酸缓冲液”），这些参数被视为次要背景。而本研究则将这些“配角”推向了舞台中央，证明了它们与核心的可电离脂质同等重要。它与那些致力于发现新型“明星”脂质分子的研究形成了完美的互补，强调了要制造出成功的药物，一流的“原料”和一流的“工艺”缺一不可。
3. 深刻见解与未来展望：
指导工业化生产： 这项工作为mRNA药物的规模化生产和质量控制提供了极其宝贵的科学依据。通过精确控制每一步溶液的pH和组分，企业可以确保不同批次产品之间的高度一致性，这是药品获批上市的关键。
实现“定制化”递送： 研究揭示了交换液pH对肝靶向性的调控能力，这开启了一个全新的思路：未来我们是否可以通过精细调控不同的工艺参数组合，来实现对LNP体内行为的“定制化”设计，使其靶向更多样的组织和器官？
超越LNP的普适性： 这种“过程即设计”的理念不仅适用于mRNA-LNP，对于所有依赖于自组装过程的纳米药物递送系统（如病毒载体、聚合物胶束、外泌体等），都具有重要的借鉴意义。它提醒我们，在纳米药物的研发中，我们不仅要问“它是由什么构成的”，更要深入探究“它是如何形成的”。
参考文献
Tang S, Huang L, Ge J, Li J, Qiu M, Zhang Y, Long M, Wu G, Zhang R, Ma X, Xia Q, Wan P, Yang T. Influence of salt solution on the physicochemical properties and in vitro/ in vivo expression of mRNA/LNP. J Nanobiotechnology. 2025 Mar 19;23(1):223. doi: 10.1186/s12951-025-03318-w. PMID: 40108620; PMCID: PMC11921543.
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