免疫组织化学（IHC）是生命科学研究和临床病理诊断中不可或缺的核心技术。它如同一把精密的“分子定位尺”，能在组织原位揭示蛋白质的空间分布与表达水平[1]。我们之前大多是围绕WB来进行主要介绍，但在评论区也有很多同学提问关于IHC的问题。今天小优细节君会对IHC实验细节和常见问题的解决方案进行总结，助同学们夯实基础，扫清障碍，得到一个满意的IHC结果图。
实验步骤
IHC是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，从而确定组织细胞内抗原的位置和含量[2]。IHC实验主要包括“样本处理→抗原修复→封闭→抗体孵育→显色→复染→封片”7 大核心步骤，一个可重复、高质量的IHC实验，必须遵循标准化的操作流程，并充分重视每个步骤的细节。
图1 IHC实验流程（石蜡切片）
一、
样本处理：实验成功的 “地基”
（一）固定
组织固定的目的是保持蛋白质的天然构象与位置。固定液的种类、固定条件等对实验都有重要的影响：
固定液种类：常用固定液有醛类和醇类两种，醛类通过与蛋白交联进行固定，更适用于可溶性的靶点；醇类是脱水固定剂，不适用可溶性靶点和修饰状态特异性抗体
固定时间：通常是室温固定24小时，严格控制固定时间，固定时间不足容易导致交联不足，抗原降解，固定时间过长易引起过度交联，掩盖抗原位点，不利于后续免疫反应
固定液体积：建议是组织体积的10-20倍，确保组织全部浸没在固定液中
固定液是否新鲜：使用新鲜的固定液，开封后存放较久的固定液的固定效果会有明显下降
（二）切片制备
常见的切片类型主要有两种：石蜡切片（Paraffin）和冰冻切片（Frozen），通常需根据自己的实验样本和实验目的选择合适的切片。
石蜡切片：固定后组织经脱水、透明、浸蜡处理，包埋成结实的蜡块，蜡块冷冻后将蜡块切为3-5μm的薄片，于45-50℃温水中展平裱贴在载玻片上。
冰冻切片：组织固定后进行沉糖处理，将组织放入在30%的蔗糖溶液中直至沉底，防止冰晶损伤。后用OCT进行包埋，应用冷冻切片机切片。
切片质量是实验成功的前提：
切片厚度：石蜡切片推荐3-5μm，冰冻切片推荐5-10μm，切片不宜过厚，否则容易造成结果背景高。
切片是否新鲜：使用新鲜样本，切片制备好后尽快进行实验，避免长期暴露于空气中引起抗原降解，导致结果阳性弱或无阳性
二、
抗原修复：决定实验成败的关键步骤。
组织样本在经过甲醛固定后会导致蛋白交联，掩盖抗原表位。抗原修复是通过热或酶学方法打破交联，重新暴露抗原位点[3]，这也是IHC能否成功的关键前提。常用的修复方法有热修复和酶修复。
（一）酶修复
通常是应用胃蛋白酶原和胰蛋白酶进行修复。
修复温度和时间至关重要：温度过高、时间过长易导致组织脱落或抗原降解；温度不足则修复不充分，无法充分暴露抗原位点。
（二）热修复
常用的热修复缓冲液有pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液或pH 8.0-9.0的EDTA缓冲液，可以用微波炉、高压锅或水浴锅加热处理。切片加热后在修复液中自然冷却至室温进行后续步骤。一般来说修复强度是高压修复>微波修复>水浴修复，且修复液pH越高，修复能力越强。但不是每个样本和靶标使用修复能力越高的修复方式效果越好，没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原。因此实验应用的修复方法和修复液很关键：
修复方法：不同的抗体需要不同的抗原修复方法和条件，建议根据抗体说明书推荐或通过预实验确定最佳抗原修复方式。
修复液pH：修复液的pH必须精准，误差不超过0.1，否则会影响修复效果。
冷却降温：切片加热后不可为了省时间用冷水快速降温，否则会导致抗原位点重新闭合修复失败。
图2 不同抗原修复方式对结果的影响。
三、
封闭
（一）内源性过氧化物酶封闭
组织内源性的过氧化物酶（多见于红细胞、粒细胞）和碱性磷酸酶会干扰HRP或AP系统的显色反应。应用3%过氧化氢室温孵育10-25分钟可以降低这些干扰，要注意的是：
过氧化氢极易分解：要确保使用的试剂是有效的，最好是应用刚开封的过氧化氢。
（二）封闭
应用与二抗同源的正常血清（如二抗为山羊抗兔，则用5%正常山羊血清），室温封闭1h。
四、
抗体孵育
（一）一抗孵育
封闭后，滴加一抗4℃过夜孵育。一抗的选择和孵育条件是重中之重：
一抗：选择质保IHC和物种反应性与样本一致的抗体，尽量选择与样本不同来源的一抗。
抗体稀释比例：抗体浓度过低会导致阳性信号弱，无法与背景区分；浓度过高则会引起背景染色，信噪比低。建议参考抗体厂家的推荐或通过预实验确定最佳稀释比例。
抗体稀释液：参考抗体厂家推荐
洗涤：一抗孵育后用PBS 进行充分洗涤，去除未结合的一抗和其他杂质，减少背景染色。
（二）二抗孵育
滴加对应种属的酶标二抗（如HRP标记或AP标记），室温孵育30-60分钟，孵育后充分洗涤。二抗建议选择具有信号放大作用的。
五、
显色与复染
滴加新鲜配制的显色底物（如DAB）后，密切观察组织切片的颜色变化，当目标区域出现清晰的棕黄色信号后，立即将切片浸入流动自来水中终止反应。这里最好在显微镜下进行，防止显色过度，否则会导致背景高，全片都是阳性信号。
显色终止后，将切片放于苏木素中进行细胞核复染，随后在冰乙酸（或盐酸酒精）中分化、氨水返蓝。
六、
脱水、透明与封片
将切片依次置于梯度乙醇中脱水，二甲苯透明，最后滴加适量封片剂进行封片，封片要注意不要有气泡，否则影响结果观察且易脱落。
常见问题分析与解决方案
在IHC实验中，挑战无处不在。这里总结了一些常见问题和解决方案，对照遇到的问题进行快速定位原因，下次实验就能避开这些坑！
无特异性信号或信号弱
（一）可能原因
1. 样本问题：组织中目标蛋白不表达或表达量极低；切片保存过久；固定过度导致抗原永久性遮蔽。
2. 抗原修复不当：方法错误；修复液pH值或时间不恰当
3. 一抗：是否可用于IHC，一抗稀释方法和稀释比；孵育时间和抗体效价。
4. 二抗不合适，显色时间短或显色底物失活。
（二）解决思路
1. 设立阳性对照：确保阳性对照有信号，证明实验体系无误；若无，则检查一抗、二抗及显色系统；使用新鲜制备的切片；
2. 缩短固定时间：样本固定不超过24-48小时。
3. 抗原修复：尝试不同的修复方法与缓冲液pH值，使用新鲜配制的修复液；
4. 优化一抗：进行抗体梯度稀释测试，寻找最佳浓度；确认一抗种属与二抗匹配；抗体现配现用。
5. 使用具有放大信号的二抗，延长显色时间；DAB现用现配。
高背景
（一）可能原因
1. 切片储存时间较久。
2. 脱蜡不彻底或孵育过程中干片；内源性过氧化物酶淬灭不完全。
3. 一抗浓度过高或孵育时间过长；二抗非特异性结合或二抗浓度过高。
4. 封闭不充分；洗涤不彻底。
5. DAB显色过度。
（二）解决思路
1. 使用新鲜制备的切片，切片制备好后在一周内进行实验。
2. 使用新鲜的二甲苯，延长脱蜡时间和次数；实验中使用湿盒，全程保持切片湿润；延长过氧化氢阻断时间，或提高其浓度至3%。
3. 降低一抗/二抗浓度，调整孵育时间和温度；同时增加一个二抗对照（不加一抗，只加二抗）
4. 优化封闭：应用二抗同来源血清进行封闭，延长封闭时间。增加一抗和二抗孵育后的洗涤次数和时间。
5. 严格控制显色时间，显微镜下随时观察，及时终止显色。
染色位置不对
（一）可能的原因
1. 固定方式不恰当。
2. 抗原修复不适合；是否进行通透处理；洗涤不充分
3. 抗体非特异性结合
（二）解决方案
1. 更换不同的固定液，对于细胞样本，可以尝试用预冷甲醇进行固定。
2. 尝试更换不同的抗原修复方式。
3. 增加样本通透处理，在一抗孵育前用0.3% TritonX-100，室温通透10~15min。
4. 更换不同的一抗进行对比实验。
IHC是一门兼具科学与艺术的技术。掌握其原理是根本，严谨执行标准化流程是保障，而面对问题时系统性的排查与解决能力，则是实验者从新手走向专家的关键。每一次成功的染色，都是对细节的尊重和对科学的精准诠释。希望小优细节君今天的总结能成为您实验道路上的得力助手，助您拨开迷雾，收获清晰、可靠、可重复的完美结果。
部分相关产品：
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产品货号 |
产品名称 |
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SignalStain® Antibody Diluent |
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SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) |
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Anti-Rabbit and Mouse HRP&DAB IHC detection kit |
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Anti-Rabbit and Mouse HRP-DAB IHC detection kit (2-step) |
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OneStep polymer HRP Goat anti-Rabbit and Mouse IgG (H+L) (specific for IHC) |
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4%多聚甲醛（通用型组织固定液） |
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OCT包埋剂 |
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过氧化物酶封闭液（H2O2法） |
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山羊血清 |
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Tris-EDTA抗原修复液（10×，pH9.0） |
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柠檬酸钠抗原修复液（50×） |
参考文献:
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