【小优细节君】cFos组化/荧光不好做？一文帮您解决！

1、组织固定与取材时机：

在神经科学研究中，动物经刺激后60- 90 分钟取材可捕捉到表达峰值[2]。固定采用 4% 多聚甲醛经心脏灌注（脑组织），避免甲醛过度固定（固定时间不超过 24 小时），防止抗原遮蔽；或经 30% 蔗糖脱水后制作冰冻切片。固定后用 0.1% Triton X-100（PBS 配制）室温孵育 10 分钟进行透化，以确保抗体能够进入胞内结合。或者将Triton X-100加入封闭液和抗体稀释液中，确保破膜到位。

2、切片与抗原修复：

冰冻组织厚度控制在 10-20 μm，确保组织完整性；抗原修复是IHC成功的关键点之一，常用的方法有酸缓冲液（pH 6.0）热修复法和碱缓冲液（pH 8.0）热修复法，可以根据抗体说明书或实际的染色效果进行选择和优化。

1、封闭与抗体孵育：

建议采用二抗同来源血清室温封闭 1 小时，一抗采用4℃湿盒孵育过夜，可以有效避免室温孵育导致非特异性结合；二抗室温孵育即可。

2、显色与复染：

IHC显色采用 DAB 底物，需在显微镜下实时观察，待阳性信号清晰（细胞核呈棕黄色）且背景较低时，立即用蒸馏水终止反应，避免显色过度；进行IF实验时核染用 DAPI室温避光孵育后，即可封片。

1、阳性结果判读：

在IHC实验中，正常阳性信号呈细胞核内颗粒状或弥漫性棕黄色染色，细胞质应无明显着色（静止期细胞可微弱表达于胞质）。定量分析时，采用 ImageJ 软件计数阳性细胞数，计算阳性率（阳性细胞数 / 总细胞数 ×100%），每个样本至少选择3个独立视野，确保数据可靠性。

Fig 1  小鼠脑样本

Fig 2  小鼠皮层样本，红色信号为Neurofilament-L

2、常见问题解决：

a. 若出现无信号，可以设置阳性样本组进行对照实验，也可以进行WB实验辅助排查样本中靶标蛋白表达水平。

b. 若出现信号弱，可能是抗体孵育时间不足或荧光淬灭，可延长一抗孵育时间、浓度，调整封闭和清洗步骤，荧光信号弱还需留意在封片后立即成像；

c. 若出现定位在胞质的异常染色或染色不均匀，可能为固定不及时导致蛋白扩散，或由于抗原修复不充分造成，可以尝试将取材至固定的时间间隔控制在30分钟内；延长热修复时间，或调整修复方式。另外可以设置阴性对照组排查样本自荧光及抗体非特异性结合。

d. 若背景过高，可能是封闭不充分或抗体浓度过高，可延长封闭时间，或降低抗体稀释比例。

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