抗体，又称免疫球蛋白，是由人体免疫系统中的B淋巴细胞在受到抗原刺激后增殖分化形成的浆细胞所分泌的一种蛋白质。抗体的结构如同一个“Y”字形，由两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键连接而成。想要得到高纯度的抗体用于后期的应用，进行抗体纯化是必不可少的重要技能，接下来，小优就带你一起看看抗体纯化的重要知识点吧。
一、抗体的基本性质
在纯化抗体之前，需要我们对抗体的基本性质进行收集和了解，以指导我们制定更合理的纯化方案。对于蛋白纯化来说，我们在纯化之前需要了解目标蛋白的分子量，等电点，疏水性和稳定性等性质。
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分子量
IgG抗体的分子量为150-170KD：重链为50-75KD，轻链为25KD。IgM的分子量为900KD；使用分子筛去除聚集体时可以选择Superdex 200 Increase（货号：28990944），这款分子筛的分离范围 10-600 KD，适合抗体纯化。
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等电点
抗体的等电点从PH4.0-9.0不等，大部分超过PH6.0；
使用离子交换层析，可以使用阳离子捕获或者阴离子流穿模式，去除大部分 DNA、HCP 和内毒素等杂质。
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疏水性
大多数 IgG 疏水性强，单抗在硫酸铵 30-50% 时会沉淀，可重溶后直接上疏水层析。可以考虑使用0.5-1.0 M 硫酸铵结合疏水介质。
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PH稳定性
在一般缓冲液中较稳定，应避免长时间处于较酸性的环境；使用ProteinA或者ProteinG酸性洗脱时，需要在收集管中加入中和试剂，以防止抗体变性。
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聚集体
没有保护剂的情况下 IgG 浓度高于 2mg/ml 易形成多聚体；
在pH<3的情况下，抗体会发生不可逆聚集；盐浓度过高增强抗体的疏水聚集。
二、前期处理
在上层析柱纯化之前，样品处理的步骤必不可少。细胞上清和血清中杂质较少，可以通过离心和过滤的步骤后使用层析柱进行纯化；
如果抗体来源是动物腹水，样品中会含有大量的脂蛋白和血清蛋白，需要进行特殊的处理，可以参考以下的方法：
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方法一:在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡萄糖酐能够沉淀脂蛋白，沉淀可以通过离心除去。步骤如下：
（1）每毫升样品中加入 0.04ml 10% 的硫酸右旋葡萄糖酐和 1ml 1M 的 CaCl₂；
（2）混合 15 分钟；10000 xg离心 10 分钟；丢弃沉淀；
（3）使用脱盐柱将样品置换到适合纯化的缓冲液中。
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方法二:PVP 能产生一个 pH 依赖的沉淀效应，PVP 在 pH=7.0 时能够沉淀 β- 脂蛋白和球蛋白，但是脂蛋白不能在低于 pH4.0 时沉淀。步骤如下：
（1）加入固体 PVP 到样品溶液中，至最终浓度为 3%（w/v）；
（2）在 4 度搅拌 4 小时；17000 xg离心；丢弃沉淀；
（3）使用脱盐柱将样品置换到适合纯化的缓冲液中。
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方法三：使用饱和硫酸铵处理。步骤如下：
（1）4℃ 以 10000 ×g 离心样品；
（2）加入 1 份 1M Tris-HCl（pH8.0）到 10 份样品中以维持 pH；
（3）轻柔搅拌，加入饱和硫酸铵溶液，逐滴添加至饱和度达到50%；搅拌一个小时；
（4）10000 ×g 离心 20 分钟；离心后丢弃形成上层的脂蛋白。使用等体积等密度的硫酸铵溶液清洗沉淀两次；
（5）使用脱盐柱将样品置换到适合纯化的缓冲液中。
三、抗体纯化
抗体纯化可以按照亲和层析—离子交换/疏水层析—凝胶过滤层析三步方法进行。由于ProteinA/G蛋白具有较为特异性的吸附抗体的性质，所以第一步通常是使用ProteinA/G层析柱或者填料进行亲和层析；第二步可以选择离子交换或者疏水层析去除一些核酸，宿主蛋白和内毒素等杂质；最后一步使用凝胶过滤层析精纯，进一步去除痕量杂质和抗体聚集体。由于ProteinA/G填料的高特异性，一般一步亲和层析就可以达到90%的纯度，后续如果需要去除宿主核酸，HCP，内毒素，聚集体等杂质，可以进行进一步纯化；
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ProteinA和ProteinG填料怎么选择？
和ProteinA填料相比，Protein G Sepharose 可以广泛、更强地结合更多类型的 IgG，多克隆 IgG 及人 IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配基脱落也相对更低。具体可以参考下面的图片，加号越多表示结合能力越强；
Protein A 的载量（50 mg 人 IgG/mL Protein A Fast Flow，货号17127901）相比于 Protein G（18 mg 人 IgG/mL Protein G Fast Flow，货号17061801）更高。
和ProteinG填料相比，ProteinA填料洗脱pH更加温和，更适合于保持抗体的稳定性。
需要特别注意的是，针对小鼠的 IgG1，Protein A 结合相对弱。此时可以考虑两种纯化方案：（1）使用ProteinG填料进行纯化，但由于 Protein G 结合力较强，因此有时需要 pH 低于 2.0 才能有效洗脱，容易导致对酸敏感的抗体聚集沉淀；（2）或者也可以考虑使用结合力相对较弱的 Protein A 填料进行纯化，结合缓冲液中需要加入 0.5-3M 的氯化钠以增加结合能力，目标抗体在 pH4.5 左右就可以被温和的洗脱。
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ProteinA,ProteinG的纯化缓冲液是什么？
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ProteinA填料：
结合缓冲液：20 mM sodium phosphate, pH 7.0
洗脱缓冲液：0.1 M sodium citrate,pH 3-6
在收集管中预先加入60-200ul 1M Tris-HCl pH 9.0 /ml收集液；
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ProteinG填料：
结合缓冲液：20mM sodium phosphate, pH 7.0
洗脱缓冲液：0.1 M glycine-HCl,pH 2.7
在收集管中预先加入60-200ul 1M Tris-HCl pH 9.0 /ml收集液；
注意：因为抗体纯化采用酸性溶液洗脱，为了防止抗体变性，需要预先在收集管中加入中和溶液Tris-HCl。
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ProteinA,G填料如何清洗？
常规的ProteinA,G填料不耐碱，建议反向清洗：
（1）对于沉淀或变性的蛋白：用 6M 盐酸胍清洗 2 个柱体积，立即用 5 个柱体积的 pH 7-8 结合缓冲液来清洗，反向冲洗，每次清洗时间不超过 10min。
（2）对于去除疏水性的物质（如疏水性蛋白、脂蛋白、脂质）：使用非离子型去污剂，如 0.1% Triton X-100，37 度孵育 1min。立即用至少 5 个柱体积的结合缓冲液清洗；或者 70% 乙醇浸泡 12 小时左右，然后立即用 5 个柱体积的 pH 7-8 结合缓冲液来清洗。注意 70% 乙醇处理时，需要降低流速。
盐酸胍的清洗效果有限，如果想要彻底清洗填料，可以选择耐碱的ProteinA填料。MabSelect SuRe填料（货号：17543801）可以耐受0.5M NaOH清洗；MabSelect PrismA填料（货号：17549801）可以耐受1M NaOH清洗，持续保持高性能。
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洗脱液尝试降低pH，抗体发生沉淀？
可以尝试在洗脱液中加入0.5-1M精氨酸，使用0.5M arginine-HCl体系洗脱。精氨酸有利于稳定蛋白，提高回收率和防止抗体聚集；
或者也可以考虑换成Protein A填料，可以在更高的pH条件下洗脱；
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ProteinA,G填料如何保存？
为了抑制微生物生长，抗体亲和层析填料的储存液一般是20%乙醇或2%苯甲醇，储存温度：2-8 ℃。储存液在长期保存过程中需要定期更换。
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抗体片段如何进行纯化？
Cytiva针对抗体的不同片段都有特异性的产品，可以根据下图进行选择：
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