酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是目前应用最广泛的免疫学检测技术，是将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。一般用酶标测定仪测定吸光度（OD值）来反映抗原或抗体含量，灵敏度可达每毫升纳克（ng）水平甚至皮克（pg）水平。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
目前常用的ELISA方法有直接法、间接法、双抗夹心法、竞争法ELISA。在测定蛋白质等大分子时常用双抗夹心ELISA方法。
双抗夹心法ELISA
实验原理
双抗体夹心法是检测大分子抗原最常用的方法。双抗夹心法ELISA是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检样本中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体—抗原—固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。
双抗夹心法原理
样本准备
A. 血清
全血标本自然凝集30 min后1000×g离心15 min，取澄清，即可检测。澄清可存放于-20℃，避免反复冻融。
B. 血浆
可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 min内于2-8℃1000×g 离心15 min，或将标本放于-20℃，避免反复冻融。（注意：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测）
C. 细胞上清
收集细胞培养液，离心取上清，-20℃存放，避免反复冻融。
D.细胞裂解样本
1. 收集细胞后，用预冷的10mM PBS洗3次，5000×g离心5 min。
2. 细胞计数，离心弃上清；
3. 加PMSF至细胞裂解液中，终浓度为1mM；
4. 按每1×107个细胞，加入1ml细胞裂解液（含PMSF），冰上裂解30 min，其间上下颠倒使裂解更充分，超声波破碎处理；
5. 4℃，10000×g离心10 min；
6. 检测细胞裂解样本总蛋白浓度；
7. 整个过程需在冰上操作，防止蛋白降解。
E. 组织裂解样本
1. 加PMSF至细胞裂解液中，终浓度为1mM；
2. 预先将待检组织用剪刀剪碎，液氮研磨，再按每100mg组织加1mL裂解液，用研磨器进行研磨，得到的匀浆液可利用超声破碎处理；
3. 4℃，10000×g离心10 min，取上清，-80℃存放；
4. 检测组织裂解样本总蛋白浓度；
5. 整个过程需在冰上操作，防止蛋白降解。
实验操作流程
配置标准品
加入样品及标准品
第一次洗板
加入生物素化抗体工作液
第二次洗板
加入酶结合物工作液
第三次洗板
加入显色剂
加入终止液，立即上机
常见问题及解决方案
注意事项
优质的试剂、良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。一些细节操作不当就会对试验结果造成很大偏差，因此我们在实验中应注意以下事项：
1. 加样
不规范的移液操作可能带来 0.1％到 5％ 的移液误差，甚至更高！
移液器定期校准：选择密封性好质量可靠的吸头，吸量不准确，直接影响检测结果。
加样前，溶液充分混匀，垂直悬空加入液体，避免加在孔壁上或产生气泡。
加样时，避免液体溅出，如有样本溅出，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录。
如果移液器漏气致使加样量不足，可先吸出（尽量吸净） 后加入需求量，并做好相应记录，若结果在灰区，需要复核检测。
每次加样顺序一致，尤其底物、终止液顺序一致，保证每个孔显色时间相同。
2. 试剂盒使用前室温平衡
温度是 ELISA 结合反应的重要影响因素，为使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有的试剂平衡至室温，包括检测样本，避免因温度的动力学反应差异而导致 ELISA 检测结果的不准确。
实验前将试剂盒所有组分取出置温箱(25±3℃）回温至少 30 分钟，实验完成后放回 2~8℃保存。
禁止非同批次的试剂盒进行使用。
抗原包被板用多少裁多少，将没有用完的包被板放于 2-8℃存放备用。
避免显色液暴露于强光，避免接触氧化剂。
浓缩洗涤液用蒸馏水或纯水稀释，如果发现有结晶加热使其溶解再用。
3. 标准品的溶解与稀释
严格按说明书要求进行。
ELISA 标准曲线是结果计算的尺子，标准品是 ELISA 实验成功与否的关键点。
标准品短暂离心，让因运输沾到管盖、管壁的标准品沉到管底。
根据说明书加入一定体积的蒸馏水（或说明书指定溶液），加水后轻柔涡旋震荡，室温静置混匀。
4. 标准品和样本做复孔
为了获得更准确的实验结果，标准品和样本进行复孔检测。
计算平均值，确保实验结果更准确。
解决实验中失误操作造成的跳孔现象。
计算 CV 值，对实验的操作和试剂盒的精密度进行评估。
5. 孵育
孵育时，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡，应注意孵育的温度和时间应按规定力求准确。
根据说明书进行孵育，并注意避光。在进行室温反应时，若环境温度与规定条件偏差较大，可使用恒温培养箱进行有效温育。
6. 洗涤
手工洗板，拍板时要垂直， 避免交叉污染，用力不能过猛致使液体返溅。
机器洗板应经常检查冲洗头是否畅通，若被异物堵塞可用纤细针头挑出。并注意维护保养，每天使用后用纯化水或去离子水冲洗管路，保持管路洁净。
洗涤后反应板尽量扣干；扣干使用的吸水材料应为无尘材质，避免污染反应孔； 扣干后的反应板立即加液，不能干板太久影响反应。
7. 检测
酶标仪使用前务必预热 10~15 分钟，使结果更稳定。
长时间高湿度容易损坏酶标仪滤光片， 长时间不用酶标仪时，需要定期开机维护，以保证设备性能正常。酶标仪每年均需定期校验，保证测定结果准确。
根据说明书要求在规定波长条件下使用酶标仪进行结果读取。有些说明书规定双波长测定，该方法可以最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。
TMB 是 ELISA 检测中常用的底物，经 HRP 作用后显蓝色，经酸终止后，TMB产物由蓝色呈黄色， 最适吸收波长为 450nm。
福麦斯生物ELISA试剂盒
福麦斯生物推出的ELISA产品线，涵盖四种常见实验种属，目前多达405种指标，包括细胞因子、炎症因子、生长因子、趋化因子等，被广泛应用于多种研究领域。
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