解析大脑神经环路的功能连接（functional connectivity）是理解脑功能运作机制的关键。为了探究信息如何在三维脑网络中处理和传递，科学家们不仅需要“看到”神经元的活动（记录），更需要精准“控制”神经元的活动（操控），以验证神经元之间的功能连接 。全光生理技术（All-Optical Physiology, AOP）通过结合双光子成像与光遗传学，已成为解析神经环路的理想手段。然而，大脑具有显著的层状拓扑结构，现有的AOP系统在研究垂直维度的跨层（Cross-layer）回路时面临严峻挑战：受限于变焦元件的物理惯性，在不同深度的焦平面间切换往往存在毫秒级的时间延迟，难以捕捉瞬态的跨层同步信号。针对上述难题，本文提出的CLAOP系统，通过基于双光路时空复用的高速跨层“读”与基于全息双光子光遗传学的高空间分辨率“写”，突破了“同步跨层读写”的时空限制。

图1. CLAOP系统原理及在揭示功能活动与连接关系的应用

CLAOP系统通过提出下述创新技术，实现了跨层成像时空分辨率与光遗传操控精度的协同优化：

1.极低延迟跨层成像：系统将激发光束（波长920 nm）分为两路，并引入约 6.25 ns 的时间延迟，再将两束光聚焦到不同深度的平面（轴向间隔最高可达 530 µm），实现基于时空复用的信号激发。再结合高速信号解复用技术，系统可在单次扫描中同时获取两个平面图像，实现了双平面同步记录。

2.精准深层光操控： 基于全息双光子光遗传技术（波长1040 nm），利用空间光调制器（SLM）生成三维全息光斑，实现了深层神经元的单神经元精度的激活。通过与跨层成像结合，系统能够在高达 396 Hz 的成像帧率下，同时记录精准光操控下深层和浅层神经元的响应。

利用CLAOP系统卓越的时空分辨率与读写能力，研究团队在小鼠的初级视觉皮层（V1）、体感皮层（S1）及海马区（Hippocampus）开展了在体研究，从多个维度验证了跨层神经回路的功能架构。

图2. 利用CLAOP在感觉皮层（S1）进行跨层光遗传操控，揭示功能活动与连接强度的关联

在初级视觉皮层（V1），研究人员利用CLAOP同时记录了浅层和深层神经元对移动光栅视觉刺激的反应。通过全息光遗传学精准激活具有特定方向选择性的深层神经元，研究发现这种微扰显著改变了跨层非靶向神经元的方向选择性。进一步的定量分析证实，神经元之间的功能活动相关性与其跨层连接强度呈显著正相关，提供了全光证据证明“功能相似即连接”（Like-to-like）的组构原则广泛存在于跨层回路中。在体感皮层（S1），结合跑步机触觉刺激实验，团队绘制了大规模的跨层连接图谱，发现连接概率随物理距离增加而衰减，且同样遵循功能耦合规律。此外，得益于优越的跨层成像时间分辨率，CLAOP系统在捕捉毫秒级瞬态信号方面展现了独特优势。通过结合新型电压探针（JEDI-2P），系统不仅实现了对海马区神经元动作电位的高速跨层记录，还能清晰捕捉到光遗传刺激诱发的靶向神经元去极化事件及非靶向神经元的响应。这种结合电压成像与光遗传操控的能力，使得在更精细的时间尺度上解析神经元间的相互作用成为可能。

CLAOP首次提供了全光学的高通量证据支持神经元功能活动（Activity）和连接（Connectivity）的相关关系，并为在体、高通量地解析大脑跨层因果连接提供了一种全新的高通量通用策略。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2025.116646