一、简介
RNA结合蛋白（RBP）作为调控基因表达的关键因子，通过与靶RNA分子相互作用在细胞生理过程中发挥关键作用，控制着RNA在细胞内的加工、运输和翻译[1]。这些调控功能对正常人体生理至关重要，RBP功能缺陷与多种遗传性和获得性疾病相关，如神经退行性疾病、自身免疫缺陷和癌症[2,3]。为探索RBP影响RNA加工的机制，RNA免疫共沉淀（RIP）和CLIP等能全面鉴定RBP相互作用RNA底物的技术被广泛应用。然而RIP-seq不能鉴定RBP在RNA上的结合位置；经典iCLIP-seq技术能鉴定RNA的结合位置，但存在失败率高、有效文库复杂度低、重复性差等问题。
eCLIP-seq（enhanced UV crosslinking and immunoprecipitation增强型紫外交联免疫共沉淀测序）是在经典iCLIP-seq技术基础上优化而成的具有高效的“蛋白-RNA”相互作用研究手段[4]。该技术首先通过紫外交联固定细胞内特定蛋白与其结合的RNA的相互作用，然后利用特异性抗体富集目标RNA结合蛋白（RBP）及其结合的RNA片段，最终通过高通量测序实现在全转录组范围内精确绘制RBP结合图谱。
作为研究转录后调控机制的核心工具，eCLIP-seq能够精准揭示RBP在RNA剪接、稳定性调控、翻译控制等过程中的分子机制，为深入理解基因表达调控网络提供了关键技术支撑。
二、实验流程
通过eCLIP-seq技术分析RBP结合的靶标RNA图谱。
1）紫外交联细胞或组织以稳定RBP-RNA的相互作用；
2）裂解样本并用RNase I有限酶切RNA；
3）用RBP特异性抗体对目标RBP-RNA复合物进行免疫沉淀；
4）RNA片段去磷酸化处理，加接头；
5）凝胶电泳并转膜；
6）切取目的片段，蛋白酶K处理，分离回收RNA；
7）反转录、加接头、构建文库；
8）上机测序。
三、技术优势
1.分辨率高：能够精确定位RNA结合蛋白在转录组上的结合位置；
2.准确度高，捕获内源真实互作分子：通过紫外交联在体内精确捕获真实的RNA-蛋白相互作用，有效避免体外结合造成的假阳性并去除间接互作RNA；
3.极大提升文库有效复杂度，显著减少冗余数据；
4.可重复性高：标准化且稳健的实验流程，大幅降低技术难度与实验失败率，支持大规模、可重复的RBP结合图谱绘制。
eCLIP-seq相对于RIP-seq的优势：
四、结果展示
1.RBP蛋白eCLIP特异性富集靶标结果表格
2.RBP蛋白eCLIP富集区可视化峰图
3.RBP蛋白结合序列motif分析
4.RBP蛋白结合靶标RNA GO/pathway分析
五、应用案例
PRMT5（蛋白精氨酸甲基转移酶5）介导的FXR1精氨酸甲基化修饰对其RNA结合活性至关重要，可增强其与mRNA的结合能力，并参与癌细胞生长与增殖过程。FXR1优先结合含有G4结构的mRNA靶标, FXR1精氨酸修饰位点突变或RNA G4结构破坏会抑制FXR1与靶RNA结合。PRMT5抑制导致FXR1蛋白不稳定，从而下调其靶标mRNA的表达,抑制肿瘤细胞的生长和增殖。
本研究利用eCLIP-seq技术，精准绘制了FXR1在癌细胞全转录组范围内的RNA结合图谱[5]。结果表明，FXR1与多个富含G4结构的mRNA靶标（包括AHNAK、MAP1B、AHNAK2、HUWE1、DYNC1H1和UBR4）结合，并调控这些mRNA在癌细胞中的表达。因此，FXR1的结构特性及其对G4 RNA的亲和性，为揭示其在口腔癌细胞中的作用机制提供了新见解，并提示FXR1-PRMT5界面可能是一个潜在的治疗靶点。
图1. FXR1 eCLIP-seq实验证明口腔癌中PRMT5-精氨酸甲基化修饰FXR1结合靶mRNA影响原癌和抑癌基因RNA稳定性进而调控肿瘤细胞增殖[5]。
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参考文献
1.Gerstberger, S., Hafner, M. & Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat. Rev. Genet. 5, 829–845 (2014)
2.Castello, A., Fischer, B., Hentze, M.W. & Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends. Genet. 29, 318–327 (2013).
3.Nussbacher, J.K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C. & Yeo, G.W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends Neurosci. 38, 226–236 (2015).
4.Van Nostrand EL, Pratt GA, Shishkin AA, et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nat Methods. 2016;13(6):508-514.
5.Vijayakumar A, Majumder M, Yin S, et al. PRMT5-mediated arginine methylation of FXR1 is essential for RNA binding in cancer cells. Nucleic Acids Res. 2024;52(12):7225-7244.