Science ：重新定义分子胶诱导新型底物识别规则，计算科学助力挖掘 CRBN 靶点空间，超乎以往认知！【深度解析】

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Science ：重新定义分子胶诱导新型底物识别规则，计算科学助力挖掘 CRBN 靶点空间，超乎以往认知！【深度解析】

韶远科技

2025-09-29

Early R&D Talking

聚焦

计算科学与靶向降解

DOI: 10.1126/ science.adt6736

Monte Rosa 聚焦在分子胶降解剂（MGD），通过其AI/ML核心技术平台 QuEEN （定量和工程化消除新底物）作为 MGDs 开发的引擎，专注于靶向传统“不可成药”疾病相关蛋白。

近期(Jul. 3)，Monte Rosa 团队在 Science 上放了了个大招——通过计算匹配算法，对 CRBN 靶标空间进行了系统挖掘，打破传统认知，重新定义了分子胶降解剂诱导新底物识别规则。

该研究披露了人类蛋白质组中存在 超1600 种潜在 CRBN 兼容蛋白：

β-发夹 G-环结合的蛋白——1424 个；

螺旋 G-环结合蛋白——184 个。

这篇研究首次发现 VAV1 通过分子表面模拟机制与CRBN 结合，无需典型 G-loop 基序。这是一种不可药物靶标，在自身免疫和慢性炎症适应症中具有广泛的治疗潜力。

相关管线已经进入了 I 期临床，并以 21 亿美元授权给了诺华。

这篇文章中的发现揭示了 CRBN 的高度可塑性，为新一代 MGDs 靶向更多“不可成药”靶标提供可能。

留言区开放，欢迎探讨！

研究背景与研究目的

1.1 背景：基于 CRBN 的分子胶降解剂

分子胶降解剂（MGDs）是一类小分子药物，通过诱导邻近，使 E3 泛素连接酶与靶蛋白（POI）之间相互作用，进而使靶蛋白在细胞的蛋白处理机制中被泛素化，并最终降解。

沙利度胺类似物是临床有效的 MGDs，可结合 CRBN，一种 CRL4^CRBN 泛素连接酶的底物受体，并通过形成复合的 CRBN-药物新表面，来重新设定底物选择性，从而能够与所谓的新生底物蛋白（POI，CRBN 兼容蛋白）结合。

药物诱导的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）促进新生底物的募集，进而驱动与 CRBN 的协同复合物形成。这种机制不需要靶蛋白上预先存在可成药口袋，因此，为药物开发开辟了新的途径。

1.2 普遍认知：局限性的科学问题

鉴于分子胶降解剂的特殊机制与优势，基于CRBN 的分子胶降解剂备受关注，并且在发展过程中形成了若干传统普遍认知。

（1）传统认知1：新底物靶蛋白识别的结构依赖性

传统观点认为，所有可被 CRBN 分子胶诱导降解的蛋白都必须含有一个共同的结构特征，即，β-发夹 G-loop 降解决定子（degron，含有关键甘氨酸残基与 CRBN 结合）；如下图 A，以来那度胺介导 CRBN-CK1α 邻近诱导为例;

此外，靶点 G-loop 的 G-1、G-2、G-3 位置羰基必须与 CRBN 的 N351、H357、W400 形成氢键网络，并认为这是三元复合物形成的必要条件，还是以CK1α 为例，如下图。

（2）传统认知2：靶标类型的局限性

传统认知认为，G-loop 是唯一可识别的 degron，只有具备 G-loop 序列/结构特征的蛋白才能被 CRBN 识别并诱导降解，其他结构或表面特征被认为不具备兼容性。

因此，传统认为 CRBN 兼容靶点空间受限于 G-loop 的分布和保守性。

CRBN-MGDs 已知新底物如，CK1α、GSPT1、IKZF1/2、WIZ 等均符合这一结构特征。

传统认为，非锌指蛋白因缺乏 G-loop 基序，难以被 CRBN 招募降解，这为一系列“不可成药”靶点造成了应用障碍。

（3）传统认知3：分子胶作用机制依赖“结构互补性”

传统观点认为，分子胶通过诱导 CRBN 与靶蛋白之间的结构互补性界面形成三元复合物，且这种互补性主要由 G-loop 提供。

这种结构互补性观点即，分子填塞剂假说，认为 MGDs 仅通过填充 CRBN 的色氨酸笼（Trp380/386/400）诱导表明微变，使靶点的 G-loop 基序互补结合。

而临床 MGDs 结构相似，依赖保守的邻苯二甲酰亚胺基团结合 CRBN。

（4）传统认知4：CRBN 构象变化有限、可塑性低

传统观点认为：CRBN 的结构在结合不同分子胶和底物时变化不大，其识别界面被认为是刚性的，仅通过 MGD 诱导一个小范围的 “neosurface” 实现靶点招募。

（5）传统认知5：分子胶设计依赖经验筛选，靶点可预测性与理性设计受限

传统观点认为，由于缺乏对 CRBN 识别机制的系统性理解，分子胶的开发主要依赖于表型筛选或偶然发现，而非理性设计。

序列保守型：即依赖 G-loop 序列相似性，忽略了结构多样性；

计算工具盲区：基于结构的算法仅扫描 β-发卡，无法识别螺旋或非结构化靶点。

（6）传统认知 6：“招募即降解” 的降解效率

传统观点认为，招募即降解，即认为靶点成功招募到 CRBN 即可出发降解。

Monte Rosa 的研究利用常规、拓展认知、打破常规！

Monte Rosa 的首席数据和信息官约翰•卡斯尔（John Castle）表示，“我认为我们已经打破了那些教条，”他说，“在这方面，这是该领域的一个分水岭时刻，你可以用化学生物学，以一种以前认为不可能的方式，来解决那些不可药物的靶标。”

1.3 研究目的

对于研究目的，首先，鉴于具有 β-发卡 G-loop 蛋白的普遍性，基于传统认知，理应存在更多 CRBN 兼容蛋白可用于分子胶设计；

此外，甚至有可能超出 β-发卡 G-loop 范式所定义的要求存在。

因此，研究团队通过计算和实验方法：

（1）系统地挖掘人类蛋白质组中可能通过 G-loop 与 CRBN 结合的蛋白；

（2）探索在 G-loop 以外，是否存在识别机制；

（3）扩展 CRBN 的可靶空间，为开发新一代 MGDs 提供理论基础；

（4）探索影响降解效率的因素。

研究方法与核心发现

2.1 研究方法：计算挖掘+实验验证

研究团队利用平台优势，使用结构匹配算法，在 PDB 和 AlphaFold2 结构数据库中搜索与已知 G-loop 结构相似的基序。

并定义了两种 G-loop 模板：

（1）8 残基模板（G-5 到 G+2）；

（2）5 残基最小模板（G-3 到 G+1）。

实验验证：使用了 TR-FRET、NanoBRET、TurboID邻近标记、质谱（TMT）等技术验证预测蛋白与 CRBN 的结合及降解情况。并解析三元复合物晶体结构易揭示分子机制。

2.2 G-loop 靶点空间扩展的发现与验证

2.2.1 β-发卡 G-loop 靶点空间扩展

去除了主要存在细胞外的蛋白结构域，确定了分布在 1424 种人类蛋白中的 6123 个基元包含 G-loop 基序。

其中，成功找到了先前报道的 β-发卡 G-loop 靶点，如 IKZF1/2/3/4、WIZ、ZFP91、ZNF692、GSPT1、ZMYM2、PDE6D、WEE1。

同时，还发现了大量的 C₂H₂ 锌指蛋白：涵盖已挖掘 G-loop基序的 84%（5160个）；分布于 646 种全长蛋白质中。

相比之下，有 912 种非C₂H₂ β-发卡 G-loops基序分布在 729 种全长蛋白质中；如下图，这些蛋白分属 96 个蛋白家族，分布在 272 种结构域类型中。

还有 51 个 G-loop 基序分布在 49 种蛋白质中，偏离了典型的 β 链值而不确定结果，标注为“other”。

在这些预测中，有 70% 发现于缺乏明显小分子结构位点的结构域。

2.2.2 邻近连接实验验证

研究人员通过邻近连接实验来验证化合物依赖的 CRBN 对预测靶点的招募情况。

（1）设计并在 CAL51 细胞中表达了CRBN 构建体，其 N 端融合了通用生物素连接酶 TurboID；

（2）在化合物存在的情况下对邻近 CRBN 的蛋白质进行泛素化；

（3）对邻近标记的蛋白进行亲和纯化，并以 DMSO 处理的对照细胞作为参照；

（4）通过质谱分析。

以下三个化合物被选择用于邻近连接标记：

通过验证，众多蛋白质得以富集，其中包括先前已确定的 G-loop 靶点 CK1α、WEE1、GSPT1，以及许多 C2H2 锌指蛋白。

此外，还有未被研究过的 β-发卡 G-loop 蛋白：如，NEK7、MNAT1、PPIL4 和 CHD7 等。

研究人员还分别用 TR-FRET、NanoBRET 在体外和细胞中检测了三元复合物的形成，并进行了验证。

研究人员首先集中在对蛋白激酶的研究。

如下图 F，在激酶结构域上挖掘的 β-发卡 G-loop 序列标志与在两种直接生物物理法检测验证的激酶中 β-发卡 G-loop 序列对比。星号表示与氨基酸有关的基序位置。

在 157 个激酶 β-发卡 G-loop 中发现了潜在的氨基酸偏好，如 CAMK2D、CK1δ、LIMK1、PLK3、STK4、TRIB1、TRIB3、SCYL1。

通过化合物 1、2，在 TR-FRET 和 NanoBRET 中观察到其中 9 种激酶与 CRBN 形成三元络合物，如下图。

通过 G-loop 甘氨酸-天冬酰胺突变，以验证 CRBN 募集对 G-loop 的依赖性。

接着，研究人员探索非相关的蛋白类别和结构域类型。

通过 NanoBRET 正交实验，获得了验证，这些蛋白具有不同的功能，涵盖范围从协助折叠、剪接、染色质重塑、转录调控、和细胞运输、代谢等（如 PPIL4、HNRNPD、WBP4、CHD7、LIMD1、MNAT1、KIFC3、ASS1等）。

然而，也有部分蛋白未得到验证，如 RELB、GTF2B、MAD2L1、和WBP4 的WW2 结构域。

同时，也通过 G-loop 甘氨酸-天冬酰胺突变消除了结合，证实了募集具有 G-loop 依赖性。

这些验证表明：

（1）序列多样化的 β-发卡 G-loop 与 CRBN 兼容，且招募主要依赖于由环主链驱动的相互作用；

（2）在 C2H2 锌指蛋白之外预测的 G-loop 位置出现了氨基酸偏好，这些氨基酸偏好存在于已验证的 β-发卡 G-loop 中，与 CRBN 兼容。

即，β-发卡 G-loop 是一种普遍适用的 CRBN 结合位点模式，存在于多种不同结构域和靶标类型中，可以通过这种模式进行靶向。

2.2.3 打破常规的新发现：螺旋 G-loop 靶点发现与验证

初步的研究，证实了靶点招募是序列多样的，并且主要由 3 个 G-loop 主链羰基（G-1、G-2、G-3）与 CRBN 蛋白的 N351、H357、W400 残基形成关键的氢键相互作用驱动。

原则上，这些相互作用应该可以通过 β-发卡以外的三元折叠来满足。

因此，研究人员采用对 G-loop 结构基序定义更为宽松的方法进行重复挖掘，如下图 A、B，采用五残基最小 G-loop 模板（G-3至G+1)。

以这种方法进行再次挖掘，可预测的 G-loop 蛋白数获得了显著增加，如下图 C，最小 G-loop 模板可找到所有经过验证的 CRBN 新底物，并且包含以更严苛标准（G-5至G+2模板）定义的 95% 的识别底物。

以这种方法在 184 个螺旋 G-loop 蛋白匹配到 217 个 G-loop 基序，它们来自于 64 个蛋白家族。

这预示着存在螺旋 G-loop 基序的存在。

如，哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）的 FKBP12-雷帕霉素结合（FRB）结构域是一个高度验证了的临床靶标，它就包含一个预测的螺环 G-loop 基序。

如下图 D，TR-FRET、NanoBRET 验证了 mTOR-FRB 结构域、CRBN和化合物 1 之间形成的三元配合物，且 mTOR-FRB 的招募依赖于甘氨酸残基 G2092，证实了 mTOR-FRB 作为 CRBN 识别基序的螺旋 G-loop 的预测。

如上图 E，从分子层面探究了螺旋 G-loop 在 CRBN 上的募集机制。

mTOR-FRB 的雷帕霉素结合位点与 CRBN 或化合物 1 无接触，三元复合物的形成完全是由螺旋 G-loop 驱动的，该螺旋 G-loop 与 CRBN 的 N351、H367、W400 残基形成真实的骨架相互作用，类似于 β-发卡 G-loop 的募集以及内源性 CRBN 降解信号的募集，如上图 F-I。

螺旋 G-loop 也是一种独特的 CRBN 识别模式！

为了验证螺旋G-loop 的通用性，选择酪氨酸激酶 LCK、HCK、LYN进行验证。如下图，在 TR-FRET 筛选中，化合物 4 可与三种激酶都形成三元复合物。且在 NanoBRET 中也得到了验证。

对 G-loop 甘氨酸进行突变，则三元复合物消失，证实了招募对 G-loop 基序的依赖性。

综合以上，研究人员通过生物信息学算法确定了 1633 种蛋白质，原则上可通过 G-loop 基序被 MGD 诱导募集到 CRBN。

其中，β-发卡 G-loop 包含 1424 种蛋白，螺旋 G-loop 蛋白包含 184 种。

2.3 靶点招募的化学依赖性

由于许多 G-loop 靶点仅在基于招募的读数中得到验证，那么，差异化的 MGD 化学反应是否会导致靶点的降解呢？

为此，研究人员以 NEK7 作为 POI 进行研究，这是一种与NIMA 相关的丝氨酸-苏氨酸激酶，在自身免疫性疾病中具有应用价值。

NEK7 的 N 亚区域携带一个 β-发卡 G-loop 结构，与 CK1α 具有显著的相似之处；且 NEK7 能够与 CRBN 和化合物 1 形成三元复合物，在 TR-FRET、NanoBRET、TurboID邻近连接实验中都获得了验证。

然而，如下图 A，在 10 μM 化合物1 处理 CAL51 细胞 24 小时后，NEK7 的稳态水平并未受到影响！！！

再次筛选化合物库，发现了新型化合物 5 ，验证也可形成三元复合物，且具有中等的有效浓度，但比化合物 1 在生物物理检测中的强度更高，如下图B。

值得注意的是，同样浓度化合物 5可以诱导 CAL51 细胞 NEK7 有效降解，如上图D。

这些结果表明，非有效的 CRBN 招募，可以通过 MGDs 加强，从而诱导给定靶标的降解。

从分子层面上看，如上图 F，化合物 5 通过位于三组色氨酸笼中的二氢尿嘧啶基序与 CRBN 结合；而咪唑吡啶环和分支尾部的基序则暴露在 CRBN 表面，可供 NEK7 与之相互作用。

NEK7 与 CRBN 扩展的 PPI 界面对靶标募集和降解至关重要。

这也揭示了弱招募，可能无法引发降解；特定的化合物增强界面稳定性可有效诱导降解。

2.4 突破 G-loop 范式的新机制：VAV1 通过已知降解决定子的分子表面模拟作用于 CRBN

当前，CRBN 可通过多样化的蛋白质-蛋白质界面与靶标结合，展现出了更强的灵活性，那么是否也可推断：应该存在 G-loop 模式以外的结构排列模式，满足与 CRBN 的关键相互作用。

为此，研究团队更改了表面匹配算法，检测与已知 CRBN 降解信号序列的表面相似性，并对具有治疗价值的非 G-loop 靶标，VAV1，进行表面相似性筛选，以确定其与 CK1α、GSPT1 与 CRBN 形成三元复合物界面的相似性，如下图 A、B。

通过这种研究发现：

无 G-loop 基序的 VAV1蛋白通过其 C 端 SH3 结构域（SH3c）模拟 GSPT1的降解决定子表面，依赖化合物6 诱导 CRBN 结合与降解。

关键界面由 RT环（R798/S799）和色氨酸残基（W820/W831）构成，通过突变实验也证实了这些基序的必要性。

2.5 CRBN 预测新底物 PPI 热点区域

CRBN 上的主要作用位点 N351、H357、W400等残基具有极强的可塑性，与G-loop 结构域以及 VAV1 特异性结合模式兼容。

这个主要的作用位点是 CRBN 表面一个更大规模的蛋白-蛋白相互作用热点的核心部分，具有很高对的预测性，表明其具有参与PPI 的倾向，如下图 A。

与 NEK7、VAV1 以及其它结构已确定的新底物相同， CRBN 的 PPI 热点为通过靶标特异性的相互作用实现提供了机会，如上图 B。

PPI 热点跨越连个灵活连接的 CRBN 域，即 LON域和 CULT域，这些域在化合物结合后发生显著变构重组，从而为靶标的结合做好准备。

如 NEK7 以部分开放的结构域形式与 CRBN 结合，这表明，CRBN 的内在变构灵活性可能是 MGD 能够动态调控其 PPI 的格局，从而实现以前未被发现的靶标结合机制。

总结与展望

这篇文章证明了结构相似性和表面相似性均可用来通过计算预测和解释靶标对 CRBN 的招募情况，并且为 β-发卡 G-loop 以及超越该模式的情况下扩展 CRBN 兼容靶标空间提供了更多的机会。

文章预期，新底物（即研究 POI）互补性取决于：

（1） CRBN 蛋白相互作用热点；

（2）三元复合物界面两侧的构象灵活性；

（3）通过 MGDs 多样化来调节中心表面特征的能力。

未来的计算挖掘方法将模拟人类蛋白质组中存在的分子表面与 CRBN-MGD 新表面的多样性之间的互补性，以发现具有治疗潜力的 CRBN 兼容靶标。

此外，Monte Rosa 的 VAV1 降解物，通过靶向免疫相关信号蛋白，可能治疗自身免疫性和慢性炎症性疾病。制药巨头诺华公司以 21 亿美元的价格获得了 Monte Rosa 一种 VAV1 降解剂 MRT-6160 的授权，该药物目前正处于一期临床试验阶段。

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