Cancer Letters | 一种减少生长因子的结直肠癌培养系统

由于早期结直肠癌类器官(Colorectal cancer organoids, CRCOs)体外培养成功建立了CRCOs培养体系，并对这些类器官进行了组织病理学、遗传学和致瘤性等多方面的评估。通过考虑微环境信号和保持肿瘤特征的信号通路，一种含有Wnt通路激动剂(Wnt3a和R-spondin 1)、BMP抑制剂(Noggin)、EGFR通路激活剂(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF10)的CRCOs培养体体系已被建立。尽管大多数CRCO培养系统在保留肿瘤异质性的情况下始终能够成功构建类器官，但它们往往忽略了肿瘤异质性和纯度的保存。因此建立一种能够更好地保留原始肿瘤特征的CRCOs最佳培养体系是非常重要的。

2024年2月，陈晔光院士团队在《Cancer Letters》上发表了题为《A growth factor-reduced culture system for colorectal cancer organoids》的文章，他们探索类器官培养配方来捕捉结直肠癌的肿瘤特征，发现Wnt和EGF信号的激活以及BMP信号的抑制对于大多数结直肠癌类器官(CRCOs)的存活并不是必需的。他们设计了一种含有FGF10、A83 -01 (TGF- β I型受体抑制剂)、SB202190 (p38 MAPK抑制剂)、胃泌素和烟酰胺的生长因子减少培养基。通过组织病理学、遗传稳定性、致瘤性和临床治疗反应，该培养基可以在CRCO长期培养中保持肿瘤特征。

首先，他们发现外源性生长因子对CRCOs不是必需的。虽然EGF、Noggin和R-spondin (R-spol)对大多数正常的类器官培养至关重要，但各种突变可以促进癌细胞在没有这些生态位银子的情况下存活。为评估CRCO培养的最低要求是什么，作者团队测试了不同生长因子组合的培养条件。结果显示，大多数肿瘤样本可以在没有Wnt3a、R-spol、EGF和BMP拮抗剂Noggin的培养基中建立类器官并维持较长的存活时间，由于该培养基中含有FGF10、A83-01、SB202190 胃泌素和烟酰胺，作者团队将这一新的培养体系命名为“FASGN”,在FASGN系统的基础上，他们分别取出不同成分，探讨其是否会影响CRCO存活。虽然去除单个成分可以支持CRCOs的初始生长，但随培养时间的延长，类器官状态开始恶化。这些数据表明，这些成分对于维持CRCOs的长期培养至关重要。同时，他们通过评估更多原始样本所构建的类器官的形成速率和生长状态，来比较FASGN系统和广泛使用的培养基的效果，结果证明，不同代次中类器官的形成、形态和生长速度均无显著差异。此外，他们还检测了不同代次CRCOs中结直肠癌干细胞标志物（CD133、CD44、CD168和CD24）、干性基因（LGR5、ASCL2和AXIN2）增殖和细胞周期相关基因（MKI67和MYC）和结直肠癌特异性基因（CDX2和CK20）的表达水平。这些结果共同表明，FASGN体系足以支持CRCO的建立和长期维持。

接下来，为探索FASGN培养的CRCOs是否会发生新的遗传改变，他们使用全外显子组测序(WES)在第十代时检测了三对原发结直肠组织及其肿瘤来源类器官，不出所料，与COSMIC数据库相比，FASGN培养的CRCOS突变特征在类型上与其对应的组织非常一致，此外，CRCOs在配对肿瘤中保留了最常突变的结直肠癌基因突变谱，重叠率超过80%。这些数据表明，FASGN培养的CRCOs在长时间培养过程中保留了原代组织的基因组特征。此外，他们还发现FASGN培养的CRCOs与原发组织的基因表达模式高度一致，尤其是结直肠癌相关的关键通路基因。

之后，为了验证FASGN培养基中培养的CRCOs的致瘤性，他们将3例患者的类器官细胞皮下注射到免疫缺陷NCG小鼠的侧腹，观察肿瘤形成的时间，结果表明CRCOs的异质性保持不变。他们还将这些器官异种移植物（PDOX）进行H&E染色，原代组织、类器官和PDOX在细胞形态和组织结构上表现出高度一致。此外，结直肠癌相关标志物在这三者之间也表现出较高的一致性。综上所述，FASGN培养的CRCOs可以保留原组织的致瘤性和肿瘤特征。

图4.通过PDOX模型测试CRCOs 的致瘤性

随后，他们检查了用标准化疗方案的类器官的敏感性，当暴露于不同药物时，随着药物浓度的增加，类器官的活性表现出明显的抑制作用。而且，来自不同患者的类器官对药物的敏感性存在差异，联合使用的效果优于单独使用，说明类器官可以反应患者之间的差异性。为进一步探讨类器官药物敏感性与临场反应的一致性，他们回顾性地比较了类器官药物敏感性与临床反应的差异。总体而言，10个CRCOs中有8个具有与临床结果相同的反应。这些结果进一步表明，类器官保留了肿瘤特征，并模拟了临床药物敏感性。

最后，通过基因检测，蛋白验证的方式证明了FASGN培养的CRCOs能通过特定方式激活Wnt信号以维持生存。并且通过常见的Wnt抑制剂进一步验证发现，FASGN培养的类器官能普遍抵抗Wnt抑制剂的抑制作用。