骨组织研究背景
骨组织是一种坚硬的结缔组织，基质中含有大量无机酸盐，主要成分是磷酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙等，在组织制片时非常困难，是所有组织中最难制片的组织。
骨组织也是由多种细胞类型组成的结构，主要包括分为三大类：
间充质谱系，包括骨骼干细胞、间充质基质细胞、成骨细胞/骨细胞、软骨细胞、血管周细胞、脂肪细胞、骨膜细胞、肌腱/韧带细胞、滑膜细胞等；
骨髓造血谱系，包括造血干祖细胞、髓系祖细胞、淋系祖细胞等；
血管内皮细胞，包括type H血管、type L血管、小动脉、淋巴管等。此外还有较为丰富的神经纤维，可谓非常复杂。
在对骨组织进行样本研究时可能会遇到以下难点：
1. 细胞异质性：骨组织包含多种不同类型的细胞，它们具有不同的功能和特征，研究如何准确鉴定和区分这些细胞是一个挑战。
2. 细胞来源和分化途径：确定不同细胞类型的来源和分化途径，特别是骨骼干细胞的起源和发展过程，对于理解骨组织的形成和再生具有重要意义。
3. 细胞相互作用：骨组织中的细胞之间存在复杂的相互作用关系，包括细胞信号通路、细胞间通讯等，研究这些相互作用对于揭示骨组织的生理和病理过程至关重要。
4. 细胞定位和空间结构：骨组织中细胞的定位和空间结构对于其功能和相互作用至关重要，但是准确观察和理解这些结构也是一个挑战。
5. 标记和追踪技术：对于稀有细胞群体如骨骼干细胞，需要高效的标记和追踪技术来研究它们的行为和功能，而标记技术的选择和效率也是一个难点。
近日，军事科学院军事医学研究院的研究团队在Science Advances杂志上发表了题为Identification of the metaphyseal skeletal stem cell building trabecular bone （《干骺端骨骼干细胞构建骨小梁的鉴定》）的研究论文，鉴定了第一个位于长骨干骺端的骨骼干细胞群。
研究人员选择了小鼠的后肢骨骼（hindlimb bones）进行骨骼干细胞的定位和示踪研究。研究中所用小鼠的后肢骨骼组织样本覆盖幼鼠（P7～P30）和成年鼠（P180～480）。
研究方法
mIHC技术：研究团队利用mIHC技术来标记和检测骨骼干细胞特定标记物，如Sstr2、Pdgfrb、Kitl、CD200/CD51/Thy1/Ly51/CD105等，以及骨骼干细胞的分化标记物如N-cadherin、Pdpn、Sox9等，在组织原位揭示了干细胞群体的组织定位和和谱系分布情况，证实了这群骨骼干细胞对骨小梁发育的重要作用。
单细胞RNA测序分析：研究团队利用单细胞RNA测序技术对小鼠胫骨和股骨中的骨骼细胞进行分析，以鉴定并描述新的干细胞群体。
转基因小鼠模型：研究团队利用特定的转基因小鼠模型，如Col10a1-Cre;ROSA26LSL-ZsGreen，Ihh-Dre;Sstr2XER;ROSA26LSL-EYFP/RSR-tdTomato来标记和追踪肥大软骨细胞来源的干细胞群体。
基因敲除实验：研究团队进行了基因敲除实验，如Hgs基因敲除，以研究特定基因对肥大软骨细胞向干细胞的转化以及对骨小梁形成的影响。
通过以上研究方法的综合应用，研究团队成功鉴定并发现新的骨骼干细胞亚群，揭示了其在骨骼发育和稳态中的重要作用，为骨骼生物学领域的研究提供了重要的实验基础和数据支持。
实验详情
（1）骨骼样本固定在4% PFA中，并在0.5 M EDTA/磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）/0.1% PFA中脱钙。
（2）石蜡包埋样本被切成4至6μm的切片，随后进行脱蜡和抗原修复处理（Histova Biotechnology，BoneRetrival-M，BRM5L，72°C，4～6小时）。
（3）多重免疫荧光标记：切片与一抗孵育2小时，随后使用polyHRP二抗和TSA（Histova Biotechnology，NECC7100）进行荧光标记；使用洗脱缓冲液（Histova Biotechnology，ABCCC30）37°C孵育20至30分钟，温和去除一抗/二抗复合物，进入下一轮“一抗-二抗-TSA荧光标记”，直至4-7个靶点标记上相应的荧光。
本研究中应用于多重免疫荧光标记的抗体及使用稀释比例：GFP（CST，2956，1:400），红色荧光蛋白（Rockland，600-401-379，1:800），Pdgfrb（CST，3169，1:400），Emcn（Thermo Fisher Scientific，14-5851-82，1:800），Sstr2（Abcam，ab134152，1:800），N-钙粘蛋白（Abcam，ab76011，1:500），Pdpn（Sino Biological，50256-R066，1:1000），CD200（Novusbio，BAF3355，1:400），CD51（Abcam，ab208012，1:400），Ly51（Sino Biological，50082-T24，1:1000），Thy1（Sino Biological，50461-T44，1:1000），CD105（Abcam，ab221675，1:400），CD31（CST，77699，1:400），CD45（CST，70257，1:400），Ter119（BioLegend，116201，1:1000），Ki67（CST，12202，1:400），Lepr（Novusbio，BAF497，1:200），Hgs（Abcam，ab155539，1:300），和Sox9（Abcam，ab185966，1:400）。
多重免疫荧光切片使用配备405nm/458nm/488nm/514nm/543nm/594nm/633nm激光的蔡司LSM880共聚焦激光扫描显微镜平台进行成像。部分数据经过进一步处理并使用Bitplane Imaris软件（Bitplane AG）或HALO图像分析平台（Indica Labs）进行统计分析。在Imaris软件（Bitplane AG）或HALO图像分析平台上进行原位映射和定量分析。分割的细胞区块通过彩色点可视化，并叠加在组织切片上。
实验结果
mIHC骨组织染色
P7 小鼠
mIHC骨组织染色
P7.5 小鼠
mIHC骨组织染色
P14小鼠
mIHC骨组织染色
1 mounth 小鼠
mIHC骨组织染色
成年小鼠
P180和P480
mIHC/IF技术
mIHC/IF实验是一种强大的工具，被广泛用于生物医学研究和临床诊断：
多蛋白同时检测：允许在同一组织切片中检测和定量多个目标蛋白质，提供了更全面的信息。这对于了解复杂的生物学过程、信号通路和细胞相互作用非常重要。
空间分辨率：提供了细胞和亚细胞水平的高空间分辨率。研究者可以研究不同蛋白质在细胞内的定位和相互作用，有助于理解细胞功能和生物学过程。
病理分析的丰富性：在肿瘤研究中，可用于深入研究肿瘤微环境、免疫细胞浸润、肿瘤异质性等因素，有助于更准确地了解肿瘤的病理学特征。
单细胞水平信息：结合单细胞分析技术，可以获得单个细胞水平上的信息，揭示细胞亚群和细胞异质性。
荧光染色的多样性：使用多种不同的荧光染料，可以同时标记多个目标，且这些染料具有不同的激发和发射波长，避免了染料交叉激发问题。
量化和计算机分析：实验的结果可以通过计算机图像分析进行定量和定性的分析，提高了数据的客观性和可重复性。
临床应用：在临床上，可用于诊断、疾病预后和治疗决策。它可以提供更详细和全面的病理学信息，有助于指导个体化的治疗方案。
TSA染料
TSA是一种常用的信号增强技术，通过辅助酶（如辣根过氧化物酶）催化的酪胺酸酶活化剂，可以增强信号并提高检测的灵敏度。
在mIHC/IF实验中，可以利用TSA来增强染色信号，从而实现同时检测多个抗原并提高检测的准确性和敏感性。TSA技术在mIHC/IF中的应用可以帮助提高染色的清晰度和对目标分子的检测能力。
与传统方法相比，在mIHC/IF实验中使用酪酰胺信号放大的优势如下：
信号放大效果：TSA可以实现信号的放大，提高检测的灵敏度和准确性，有助于检测低表达的标记物。
特异性：TSA的信号与表位高度特异性结合，可以减少背景信号，提高检测的特异性。
多重标记：TSA适用于多重标记，可以实现多个相似物种的抗体的荧光多重免疫组织化学分析，有助于同时检测多个标记物。
序贯染色：TSA的信号是共价结合的，可以实现序贯染色，允许多次染色而不影响之前的信号，有利于多重分析的进行。
成本效益：TSA方法成本相对较低，与标准染色方法相比具有一定的经济优势。
适用范围：TSA适用于多种样本类型和实验条件，具有较广泛的应用范围。
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值得注意的是对于骨骼的组织学研究除了免疫组化之外，诸如H&E、DAB免疫组化等经典染色技术都可以使用皓赛拓华脱钙液，低温抗原修复液避免掉片。
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AbCracker®洗脱缓冲液利用固定样本与抗体之间酶靶的差异，首次成功将TSA多色荧光染色扩展到冰冻切片、骨组织切片、细胞爬片、厚组织、类器官、Wholemount以及流式细胞术。
· 滴加或浸泡15~40 min即可完全去除抗体。
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