如何开始酪胺信号放大技术（TSA）

· 减少一抗或探针的消耗量从而降低实验成本

· 检测常规方法不能检测到的低丰度样品

· 显著提高图像信噪比

· 轻松整合现有的 IHC/ISH 实验步骤

· 可降低非特异性背景的干扰

· 多色免疫荧光标记，不受一抗种属限制

· 免疫组织化学 (Immunohistochemistry, IHC)

· 免疫细胞化学 (Immunocytochemistry,ICC)

· 免疫荧光 (Immunofluoresence, IF)

· 核酸原位杂交 (In situ hybridization, ISH)

· 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 

· 免疫印迹 (Western Blotting)

· 电子显微镜成像（EM）

酪胺信号放大技术基于信号分子沉淀（CARD）原理，在过氧化氢存在时，通过抗体或探针固定的辣根过氧化物酶（HRP）将标记的底物酪胺（T）转化为具有短暂活性的中间状态（T*）。

被激活的底物分子（T*）迅速与相接蛋白分子的富含电子区域（酪氨酸残基）进行稳定的共价结合；由于相接的蛋白（如 HRP，抗体，目标抗原）都含有大量的酪氨酸结合位点，所以会富集大量信号，使其检测信号得到几何级放大。

与普通免疫荧光相比，TSA 技术可将 IHC 检测灵敏度提高 1000 倍。DendronFluor®枝杈荧光TSA专利检测技术可将蛋白及核酸的检测灵敏度提升到前所未有的高度。

同种属一抗在同一样本中的多色荧光标记一直是难题。TSA 技术利用荧光化合物的热稳定性，采用微波煮沸的方式将附着在样本上的<一抗-二抗-HRP>复合物变性和解离，而荧光化合物则始终结合在样本原位。

在下一轮 TSA 荧光标记过程中，新的<一抗-二抗-HRP>复合物将新的荧光化合物结合在样本原位。通过 N轮重复的“标记→抗体解离”步骤则能标记 N 种荧光。这是TSA 多色荧光标记不受一抗种属限制的原理和精髓。

如果从未有过 TSA 多色荧光标记经验，建议您从“容易”的实验开始“练手”。对方法体系和实验流程的熟练把控将有助于您事半功倍！

建议您从IHC开始练手值得注意的是实验中抗体的选择：

一抗选择：选择好用的一抗及其组合，TSA多色荧光标记成功了一半！二抗选择：好的二抗也很重要！利用阳性样本进行抗体特异性验证：具有专业知识背景很重要！

建议您从好用的抗体开始练手，注意TSA与IHC、IF的区别。

TSA vs. IHC：注意样本自发荧光

· 都依靠HRP的催化作用；

· TSA信号放大作用显著强于DAB；

· TSA荧光多标需考虑样本自发荧光的影响。

TSA vs. IF：防止信号放大过度

· IF流程无需去除内源性过氧化物酶；

· IF：信号等比放大；TSA：信号非线性放大；

· 对于中高丰度靶点，请从原一抗浓度1/10~1/5开始测试使用TSA。

· 细胞实验请将TSA从1:200~500稀释开始测试。

· 设置反应时间梯度，记录最佳反应时间。

· 如需考虑表达差异，应在T2之前中止反应。

建议您从好用的抗体组合开始练手。值得注意的有三点：

（1）TSA的占位效应：“先低后高”、“先少后多” 和适度原则：先染丰度低、表达范围少的靶点，后染丰度高、表达范围广的靶点；结果清晰可见即可，不追求晃瞎眼的染色效果。

（2）染色先后顺序的确立：抗体必须逐个验证，在熟悉每个靶点及对应抗体的情况之前，不要贸然做多色标记。靶点先后顺序的选择，不能长时间修复的抗原，安排到第一轮；需长时间修复的则安排到最后一轮。遵循上述“先低后高”、“先少后多” 原则。如果存在难以去除的抗体，请安排到最后一轮。

（3）荧光先后顺序的选择：对于工业用户或者染色工作量大的用户，工作流程可能不包括镜下观察每轮染色效果，因此通常不考虑荧光先后顺序（俗称“盲染”）。

对于科研用户，边染边观察是值得鼓励的流程。以下为一般配置荧光显微镜通道可观察到的荧光，同一通道内有肉眼可见的光谱差别（例如橘红和深红）：

通道之间无先后顺序考量，但在同一通道内，建议先染低丰度靶点荧光，后染高丰度靶点；尽量先染短波长荧光，后染长波长荧光。

（4）TSA多标的平衡原则：在TSA多色标记中，荧光种类越多，通道串扰的可能性就越大，特别是对于依靠λ-stack成像原理的多光谱成像系统。下面举例“串色”发生的可能情形：

· 多色标记的荧光种类越多，越要求各荧光强度达到均衡。

· 荧光强度取决于一抗浓度、孵育时间和温度，二抗孵育时间，TSA稀释比例、显色时间乃至当天室温，务必详细记录。

· 请将各一抗与TSA荧光一一对应，测试并汇总达到荧光均衡的实验条件。

· 对于没有条件测试某些TSA荧光（如缺少显微镜Cy5通道）的用户，可用NEON520等可观测荧光代替测试，获得近似条件。

· 不同激发通道之间的串色现象很少见

例如NEON520与NEON570之间几乎不串色；但同一激发通道内；例如NEON570/NEON620、NEON650/NEON700，前者因保持一段特征光谱供识别，因此很少被后者干扰，但前者常常因染色过强而干扰后者。

经验是：低丰度靶点选择较短波长荧光，且先染；高丰度靶点选择较长波长荧光，后染。

· “新七色” 的推出旨在减少多色标记的串色现象，显著提高拆分成功率，让染色自由度更大。