随着技术进步，多重荧光免疫组化技术在生物医学研究领域中的应用越来越普遍。它能够在一个样本中进行多重荧光染色，例如穿刺样本等样本量较少的情况下同时检测多个靶标，对复杂细胞群体和组织微环境的分析更为准确和全面。
研究人员都希望在自己的片子上看到更加丰富的靶标信息进而分析得到更多数据，那么如何做出一张完美的多色片子就是首当其冲需要攻克的问题。
每一张好的多色片子都有着共同的特点——平衡。平衡好每个靶标的荧光强度，后续分析自然事半功倍。
平衡的关键包括：抗体的选择、孵育条件的优化、染料波长的搭配和染色顺序遵循的原则等。
多重免疫组化实验的基本框架是相似的，包括：样本准备（脱蜡，复水）、抗原修复、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色，抗体灭活等。
1 选择合适的抗体
选择好用的一抗，多色已经成功了一半（图1）。一抗选择：单克隆抗体 > 多克隆抗体。同一个抗原决定簇，在机体内也可以由多种克隆来产生抗体，其中由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合。而好几种单克隆抗体的混合物，称为多克隆抗体。
图 1 Occludin抗体对比
在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。注意：一抗的种属和应用范围。抗体官网一般会标注应用范围WB、IHC、IF等（图2）。
图 2 各抗体官网中一抗应用范围示例
2 孵育条件的优化
一抗孵育条件包括：孵育时间、温度和抗体浓度。
Ø 一抗可以在4 ℃、室温、37 ℃孵育，其中 4 ℃效果最佳（提高结合稳定性、减少非特异结合、还可以多次回收使用）。
Ø 孵育时间：一般 37 ℃ 1-2h，4 ℃可过夜（不超过 16~24h）。
Ø 抗体浓度：一抗的浓缩液需要先摸索使用条件，一般比做DAB的浓度低一些。
二抗孵育条件：
Ø 二抗一般室温或 37 ℃ 30min-1。
Ø 浓度一般有工作液，若是浓缩液还需摸索浓度。
在免疫组化中一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。
3 选择合适的染料
选择合适的染料，是避免串色的关键。荧光染料产生的发射光呈现山峰状分布，在峰顶的发射光虽然最强，但在其左右一定范围内也能够捕获到它的发射光，那么相邻的染料之间，难免会有信号重叠（图3）。尤其是染六色以上时，平衡好染料之间的选择是第一步。掌握各种染料的激发光和发射光，优先选择相距波长较远的荧光染料能有效避免串色。
图 3 染料的激发光与发射光
可以选用搭配好的染料组合：四色（NEON520、570、670、DAPI）、五色（NEON520、570、620、670、DAPI）、七色（NEON 480、520、570、620、700、770、DAPI）和九色（NEON 480、520、540、570、620、650、700、770、DAPI）等。
第二步则是安排好染色顺序。如果两个靶点表达丰度差异很大，两者又被安排在临近的通道，可能会发生串色（图 4）。
图 4 染色顺序不当造成串色
Ø a. NEON570 和 NEON620 在同一通道激发。当两通道的靶点表达强度相当时，光谱拆分可有效拆分两者。
Ø b. 当 NEON620 强度显著弱于 NEON570，NEON570 近红端鼓起的“小尾巴”会被误判为 NEON620 信号。
Ø c. 当串色经常发生时，可将 NEON570 换为没有“小尾巴”且 Em 间隔更远的 NEON560，可显著减少串色发生。
4 染色顺序遵循的原则
在安排染色顺序时首先遵循“先低后高，先短后长”的原则：低丰度靶点选择较短波长荧光，先染；高丰度靶点选择较长波长荧光，后染。
同时要考虑靶点的细胞定位，“先外后内”：先染膜表达的靶点，后染胞浆或胞核表达的靶点。因为抗体洗脱难度一般情况下：结构性膜蛋白和细胞骨架蛋白 > 胞浆蛋白 > 胞核蛋白。“先外后内”的顺序能尽量规避因洗脱不完全而造成的串色。
综上所述，把握好“平衡”就能做出一张好的多色片子。好的多色片子再结合合适的扫片设备，才能得到完美的数据。
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