（1）EWSR1探针在尤文肉瘤中的诊断陷阱，如阴性需加做ERG、不典型阳性可考虑用EWSR1-FLI1融合探针相验证。
（2）部分病种中EWSR1阳性并不满足诊断，如促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤vs尤文肉瘤、骨外黏液样软骨肉瘤vs软组织肌上皮瘤/肌上皮癌、小细胞（分化差的）滑膜肉瘤vs尤文肉瘤、透明细胞肉瘤鉴别等。
（3）CD99表达见于多种肿瘤，且在尤文肉瘤中也不一定都是呈膜强表达。
（4）EWSR1的伙伴基因众多，需要注意与其距离较近的伙伴基因融合时断裂探针可能红绿不明显分开。
（5）与EWSR1相邻的SMARCB1（INI1，22q11）基因缺失可能会造成EWSR1呈单绿1黄或只剩1黄的不典型异常，可能会误导诊断思路，需要用INI1探针来验证。
（6）EWSR1及其他断裂探针的红绿间距、阈值等判读问题相关。
EWSR1是一明星基因，与尤文肉瘤及多种软组织肿瘤的诊断/鉴别诊断相关。因其伙伴基因众多，临床上是设计成断裂探针使用较多。本文结合日常工作中的常见问题及可能存在的EWSR1断裂探针的诊断应用陷阱及判读陷阱，做如下归纳及延伸，供各位病理老师参考。
尤文氏肉瘤家族（Ewing sarcoma family of tumors, ESFT）包括骨尤文肉瘤和骨外尤文肉瘤、原始神经外胚层肿瘤（PNET）、骨的PNET和胸壁的小细胞恶性肿瘤（Askin瘤）。而小圆细胞肿瘤包括的肿瘤谱系较多，需要结合影像学、组织学、免疫组化特点、及相关分子检测来综合诊断，过程中可能需要用EWSR1断裂探针及相关肿瘤对应的探针来诊断及排除诊断。
1：在尤文肉瘤中EWSR1主要是与ETS基因家族成员融合，其中与FLI1融合的（t(11;22)(q24;q12)，占85%），且融合位点单一；少量（10%）是与ERG融合的（t(21;22)(q22;q12)），还有EWSR1可与ETV1、ETV4、FEV等形成融合基因，但极为罕见。
如果高度怀疑是尤文肉瘤但EWSR1断裂阴性，最好加做ERG断裂探针或EWSR1-ERG融合探针，用于排除剩余的10%这一可能。
并且，如果EWSR1探针表现为不典型阳性（如后文所述），可以考虑用EWSR1-FLI1融合探针来验证或排除是否尤文肉瘤。
2：EWSR1断裂探针呈阳性还未必就肯定是尤文肉瘤，还需注意与部分也伴有EWSR1断裂阳性、但伙伴基因不同的肉瘤相鉴别。如促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤与尤文肉瘤的鉴别，促小圆中EWSR1是与WT1融合的，需要加做WT1断裂探针或EWSR1-WT1融合探针；骨外黏液样软骨肉瘤与软组织肌上皮瘤/肌上皮癌的鉴别，两者都伴有EWSR1融合，但伙伴基因不同，加做NR4A3断裂可鉴别是否骨外黏液样软骨肉瘤。
3：EWSR1跟FUS都属于ETS基因家族，软组织肿瘤中这两个基因有着广泛的融合基因谱及对应病理亚型，下图很重要，也是引自“Hornick JL. 2019. Practical Soft Tissue Pathology: A DiagnosticApproach.”，供大家参考。
4：如上图，在黏液脂肪肉瘤中，绝大多数是DDIT3-FUS融合（90-95%），极少数是DDIT3-EWSR1融合。在部分病例中，可能存在MDM2扩增而导致的DDIT3也扩增，而不好判断DDIT3是否发生了易位，特别是伴有黏液样变的后腹膜的（低级别）去分化脂肪肉瘤。此时，可考虑用FUS断裂探针（首要考虑）或EWSR1（次要考虑）来替代检测DDIT3断裂。
5：虽然CD99在尤文肉瘤中常为膜强表达，但日常工作中也可碰到呈低表达或局灶表达的情形。且CD99在多种肿瘤中都可阳性，如在尤文氏肉瘤家族中阳性率为95%，T淋巴母细胞淋巴瘤中为92%，分化差的滑膜肉瘤中为50%，小细胞骨肉瘤中为23%，横纹肌肉瘤中为21%，促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤中为16%，小细胞癌中为9%，Merkel细胞癌中为9%。需要对相关肿瘤进行鉴别。部分需与尤文肉瘤相鉴别的免疫组化表达情况如下表（引自Hornick JL. 2019）
6：小细胞（分化差的）滑膜肉瘤也可呈CD99膜强表达，伴有局灶EMA表达，形态学与尤文肉瘤及其他小圆细胞肉瘤相重叠。特别是在小穿刺样本中，易产生困惑或造成误诊，需要用SS18（SYT）断裂探针进行诊断或EWSR1断裂探针排除诊断。
7：透明细胞肉瘤也称为软组织恶性黑色素瘤，因为在部分病例中出现黑色素细胞分化及黑色素/黑素体产生。发生于肢端的透明细胞肉瘤，其主要染色体易位为t(12;22)(q13;q12)，形成EWSR1-ATF1融合基因，几乎在所有的患者中都可检测到。其有4种融合类型，其中type1和2占比高达95%。最近，也有见于胃肠道的透明细胞肉瘤样肿瘤见报道，与t(2;22)(q33;q12)易位相关，导致形成EWSR1-CREB1融合基因。此易位随后在血管瘤样纤维组织细胞瘤中也见于报道。有趣的是，发生于胃肠道的透明细胞肉瘤样肿瘤虽然伴有这两个基因融合，但是缺乏黑色素细胞分化，虽然其呈S-100和SOX10免疫组化表达阳性。大部分这些肿瘤的组织学表现不同于经典的透明细胞肉瘤，提示其可能代表了另一种独特的肿瘤亚型。
8：尤文肉瘤中虽然EWSR1-ERG融合的比较虽然仅有5-10%，但ERG基因异常的深入研究最近也见于尤文肉瘤（Genes Chromosomes Cancer. 2016. 55(4):340-349.）。作者还发现不只是与EWSR1融合，尤文肉瘤中ERG还可与FUS融合，且具有独特的临床病理特征，在85例小蓝圆细胞肿瘤中检测到7例（8.2%）存在FUS易位，其中6例是与ERG融合，1例是与FEV融合。且FISH检测呈不平衡易位，表现为断裂探针的红色或绿色端缺失。作者强调，如果只是使用EWSR1断裂探针来诊断，可能会漏掉部分ERG阳性的尤文肉瘤，建议先行EWSR1，再行FUS或ERG检测。下面罗列其部分数据。
如上图，伴有FUS-ERG融合的尤文肉瘤组织学形态及FISH结果。（A）原始、小蓝细胞呈实性生长方式，伴有弥漫深着色及胞浆缺乏；（B.C）局部区域呈梭形细胞和黏液样改变；（D.E）呈泡状染色质及野炮胞浆，被带状纤维分隔成巢状、伴有地图状坏死。（F）所有的病例都呈CD99弥漫膜着色；FISH检测表现为FUS不平衡易位（红色信号缺失，G）、ERG（H，绿色信号缺失）、FEV（I，绿色信号缺失）。
如上图，伴有FUS融合的小蓝圆细胞肿瘤的临床病理特征。
9：EWSR1的伙伴基因众多，如果其伙伴基因位于不同染色体，那么用EWSR1断裂探针就会表现出典型的1红1绿1黄阳性信号；但是，如果其伙伴基因与EWSR1基因挨得很近，那么EWSR1断裂探针的红绿信号可能就分得不是很开，比如不到一倍信号直径距离，但有不完全挨在一起，给判读造成困扰。这里，有探针设计的原理及FISH实验条件的影响因素（放在后面讲），也有伙伴基因与其位置过近的原因。比如Mastrangelo T等人于2010年首次报道了也是位于22q12区段的与EWSR1挨得很近的基因ZSG，用常规的EWSR1断裂探针估计就表现为红绿分不开（Oncogene, 2000, 19:3799-3804）。
10：在今年美国外科病理学杂志上新发表的一篇文献“Spindle and round cell sarcoma with EWSR1-PATZ1: a sarcoma withpolyphenotypic differentiation”报道了两例病例（AM J Surg Pathol, 2019; 43:220-228），认为伴有EWSR1-PATZ1融合基因的肿瘤是梭形和圆形细胞肉瘤的其中一种亚型，伴有多表型分化。两例都呈CD99、desmin、myogenin、MyoD1、S100、Sox10、CD34和GFAP免疫组化阳性，且都呈keratin阴性。两例都表现为肿瘤内部多处坏死、多表型分化，与很多其他肿瘤易混淆，包括促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤。而我们已经知道，促小圆是伴有EWSR1-WT1融合的，而此文章是不同的伙伴基因，也提示只用EWSR1断裂探针是鉴别不出来的。更重要的是，PATZ1基因就是位于EWSR1基因的附近，都是处于22q12区段，相差仅有2M，用EWSR1断裂探针也会表现为红绿稍有分开但又不会很开，大概是在一倍信号直径以内的距离。并且，此文献的两例用EWSR1断裂FISH检测的信号都为不典型的阳性，其中一例为单红1黄，另一例为混杂的单红（5’）或单绿（3’）阳性。摘录如下。
11: EWSR1基因所处的染色体区段22q12是一热点肿瘤基因区域，比如SMARCB1（INI1，22q11）、慢粒BCR-ABL融合基因的BCR基因也是处于22q11、中枢神经系统肿瘤（CNS-PNETs）MN1基因（22q12）等。再加上EWSR1伙伴基因众多，易位过程中容易伴有第三方染色体参与进来的复杂易位、或1红1绿1黄之外的其他不典型阳性信号类型。
对于不是酪氨酸基因用药相关的基因断裂探针，只要红绿有分开，不管是否伴有红色或绿色端缺失、或整个黄色缺失，都属于不典型阳性异常，包括EWSR1基因。但是，有一种情况例外，即是INI1缺失（在EWSR1的左端，相距约5M，更靠近着丝粒区）可能会导致EWSR1基因呈红色（比绿色更靠近INI1）缺失或整个黄色缺失（整个绿色、红色探针区域都缺失），而呈1绿1黄或只剩1黄的信号类型。碰到这两种信号类型，需要高度警惕是否是INI1缺失所致，需要做INI1缺失免疫组化检测，如果为阳性，需要用INI1 FISH探针进一步确认。特别要鉴别是否是INI1缺失相关的肿瘤，而不是尤文肉瘤，如上皮样肉瘤，横纹肌样瘤等。这是诊断陷阱，容易导致误诊，如下篇文献所述。
如上图：注意这些病例的初始诊断及最后诊断的不同。
注意：INI1可呈杂合子缺失（缺一个）和纯合子缺失（缺两个）的模式，而我司的INI1缺失探针所取的内参基因（绿色）就是EWSR1断裂探针的绿色端，如果两个都缺，就说明是用EWSR1断裂探针也呈单黄的异常表现。
而酪氨酸激酶相关的基因断裂探针，需要注意是红色还是绿色端覆盖酪氨酸激酶区域，只要对应的区域的颜色探针还在，就是阳性，否则就是阴性。这也是为什么ALK断裂探针的单红1黄信号类型是阳性，而单绿1黄为阴性的原因；也是为什么ROS1的判读标准恰好跟ALK是反过来的原因。这里列举了我司跟酪氨酸激酶用药相关的断裂探针的判读阳性标准，如下图。
12：还要注意一种情况，是RT-PCR呈阳性，但因为是隐匿易位而EWSR1FISH断裂探针检测呈阴性的不符结果。其实也可通过FISH信号的不典型异常发现端倪，或可用EWSR1-FLI1融合探针来相互验证。
13：最后，是断裂探针的判读问题，日常工作中主要涉及到以下方面。
（一）红绿的间距多少才算断裂阳性？实际上，此问题比较有趣，我们先要了解断裂探针的红绿间距受哪些因素影响。（1）红绿探针的间距。不同断裂探针往往是在基因两端标记的，会存在比基因本身片段稍长点的空缺，大概会有几十-200kb的范围。因为是油镜放大1000倍，一个信号直径估计会有1-几M的探针长度，也就是几千个kb的距离。所以，断裂探针虽有此空缺，但一般都表现为红绿紧挨着或重叠成黄色。但是，我们为什么会看到红绿分开较明显呢，那是因为还跟（2）样本经处理后的染色质松散程度相关，如组织片煮得很厉害，或血液片子滴渗很厉害，就像我们自己实验室做的，经中期培养的细胞滴片的细胞核很大，且信号看起来较大偏弥散。（3）还跟观察的CCD接口相关，如放大倍数较大，细胞核及信号看起来也大，间距较大的感觉会更明显。（4）除了前述原因，还可能跟具体的染色体位点及探针长度有关，如IGH基因很长，接近1M，且在基因组中有非特异同源片段，所以此探针在杂交较好的骨髓瘤细胞滴片中偏弥散、且非特会更加明显。
大部分文献报道的红绿间距为两倍信号直径，如ALK断裂探针。肺癌中ALK主要是与EML4发生倒位融合，两者相距12M，两倍信号直径也告诉我们，对应相距12M距离的基因融合，设计成断裂探针是可明显检出的。也有小部分文献报道的是一倍信号直径。那究竟是一倍还是两倍？实际上，结合具体的样本细胞大小及镜下背景细胞的信号表现来看会更合理。比如，经低渗的骨髓细胞会较大，间距会偏大；而淋巴瘤细胞比较致密，间距相对偏小。但是，无论是两倍还是一倍，阳性细胞数多数不是零散出现的，而是成群出现。当大量肿瘤细胞表现为正常的红绿紧挨着的背景中，零星出现个别间距较大的，应该理解为个别细胞的染色质比较松散导致间距偏大更合理。
对于EWSR1断裂探针，当镜下见大量的（比如30%以上）红绿信号有分开、但又不够一倍或两倍信号直径时（至于是一倍还是两倍，可参考具体的镜下的背景细胞红绿间距加以理解），需要高度怀疑是上述相关与EWSR1紧挨着的基因发生融合，需仔细对比已有文献，有条件者可用其他方法相验证。
（二）断裂探针的阈值是多少？答：严谨来说，不同的断裂探针对应不同的应用标本类型，应该单独建立阈值。后续附上美国MD Anderson实验室建立淋巴瘤MYC断裂探针的阈值供大家参考。但是，因为试剂成本等原因，实际工作中很少有实验室会单独针对每一探针来选用拟应用的标本类型来建立阈值。这里想说的是，有一些共性的原理可供大家参考。第一个，针对组织样本，因为我司的不同断裂探针其信号强度是基本相当的，可共用相同的阈值，比如10-15%。碰到阈值附近再扩大计数，或结合HE或细胞形态来分析，比如黏液脂肪肉瘤中要避开炎症细胞的影响。
并且，肉瘤中的异质性相对更高些，比如腺泡状横纹肌肉瘤，FKHR探针会表现为复杂的信号类型。当镜下有多种异常信号类型时，需要分别计数主要的信号类型，并在报告里头分别备注出其异常类型及比例。
（三）软组织肿瘤中有些断裂探针易出现1红1绿1黄之外的其他不典型阳性信号。如上所述，非酪氨酸激酶相关基因断裂探针，只要红绿有分开，不管是否伴有红色或绿色缺失，都是属于不典型阳性。因为FISH反映的是具体探针位点的信号异常，不典型阳性反映的是复杂易位或第三方染色体参与进来的复杂异常，且往往与预后差相关。当然，有条件者需要用其他方法学相互验证，如RT-PCR或NGS。
（四）位于X染色体上的相关基因更易出现复杂异常。如TFE3，滑膜肉瘤相关的SS18（SYT）与位于X染色体的SSX1或SSX2融合。特别要注意，腺泡状软组织肉瘤中TFE3-ASPSCR1更易发生不平衡易位，而在儿童Xp11.2易位型肾癌中更多表现为平衡易位，在判读时需注意，仔细描述见我司公众号的文章“乱花渐欲迷人眼：ASPSCR1-TFE3融合在不同肿瘤中阳性类型表现不同”。
如上两图，MYC断裂在弥漫大B中呈多种混杂的阳性信号类型，或伴有5’端扩增。
如上图，EWSR1断裂探针呈单红或两红1黄的不典型异常，这种情况需要鉴别是否INI1缺失所致的EWSR1绿色探针区段缺失或EWSR1靠端粒端缺失。（图片来自我们客户）
如上图：ALK断裂探针的判读标准及示意图。
如上图。EWSR1和DDIT3的探针间距为分别为50kb和140kb，EWSR1在经培养的外周血滴片中部分细胞的红绿间距偏大（红色箭头），而黄色箭头所示的为复制后但还没完全分裂为两个细胞的中期分裂相细胞，染色质处于浓缩状态而红绿紧挨着。而DDIT3在组织样本中同样也有少量细胞表现为红绿间距偏大（接近两倍信号直径，红色箭头标记），但其周边细胞都为正常的红绿重叠或紧挨着的，这种细胞会对镜下判读产生困惑。
如上图，长度为23和56kb的探针的信号大小，注意与整个细胞核大小来对比着看。
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