撰文：一粟尘
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亮点：
本文报道了一种名为PRISM（Profiling of RNA in situ through single-round imaging）的革命性空间RNA成像技术。该技术通过创新的颜色强度分级编码策略和半径矢量过滤算法，首次在单轮成像中实现了高达64重RNA转录本的空间检测，且仅需常规荧光显微镜即可完成。PRISM突破了传统荧光显微镜的通道限制（通常≤5通道），无需流体循环系统或多轮标记-剥离操作，将全流程时间缩短至24小时内。研究团队成功将其应用于小鼠胚胎发育三维图谱（涵盖E12.5-E14.5阶段420万细胞）、人肝癌微环境（120万细胞解析）及小鼠脑组织亚细胞RNA定位，不仅揭示了癌症相关成纤维细胞（CAFs）介导的免疫浸润屏障机制，还以亚微米分辨率解析了胚胎器官发育的动态互作网络。这一技术显著降低了空间转录组学的设备门槛与时间成本，为临床病理和发育生物学研究提供了高效工具。
近日，Nature Biotechnology发表了北京大学黄岩谊/郑春红团队领衔的研究成果。本研究开发的PRISM技术通过巧妙融合分子编码与计算优化，解决了空间RNA成像领域长期存在的多重性（multiplex）与可及性（accessibility）矛盾，为广泛生物学实验室提供了无需昂贵设备的单轮高重数成像解决方案。
空间RNA成像技术对于揭示组织微环境中细胞与亚细胞水平的转录组异质性至关重要，但其广泛应用仍面临多重挑战。传统荧光显微镜受限于光谱重叠，通常仅能区分3-5个荧光通道。为提升检测通量，现有方法如序贯荧光原位杂交（seqFISH）需依赖复杂的流体循环系统进行多轮标记与信号剥离，不仅耗时长达数天至数周，还因样本形变导致信号定位偏差。流体依赖设备整合了精密温控、流体驱动与光学系统，成本高昂且操作繁琐，难以在常规实验室普及。
近年来，虽涌现出超分辨显微、荧光寿命成像等无流体技术，但其多重性提升有限（通常<20重），且需特殊设备支持。例如，伪热多重通道（pseudothermal-plex）和结合亲和力标记（binding-affinity labeling）虽摆脱了流体依赖，但仍需定制化显微镜或温控装置。此外，三维组织成像因试剂扩散缓慢及三轴对齐难题，进一步增加了技术复杂性。因此，开发一种仅需常规显微镜、单轮成像即可实现高重数检测的空间RNA分析方法，成为领域内亟待突破的瓶颈。
研究设计
PRISM技术的核心在于颜色强度编码与半径矢量过滤策略（图1）。首先，设计针对目标RNA的padlock探针，其条形码由四个片段组成，每个片段对应一个荧光通道（如Texas Red、Alexa Fluor 488、Cy5、Cy3），并通过滚环扩增（RCA）产生大量重复序列。关键创新在于：每个通道可编码多个强度等级（如0%、25%、50%、75%、100%），通过竞争性杂交将标记与未标记的成像探针按预设比例混合，实现荧光强度的精确调控。理论编码容量达nm（m为通道数，n为强度级数），但实际中因RCA扩增产物尺寸不均，部分编码在颜色空间中难以区分。
为此，团队提出半径矢量过滤算法：将每个编码视为颜色空间中的矢量，约束三通道强度总和为固定值（如Ch1+Ch2+Ch3=4），仅保留矢量夹角足够大的编码，确保其可区分性。结合第四通道（Cy3）的双强度设计（0或1），最终实现30-64重的高效编码。实验流程涵盖padlock探针结合、RCA扩增、一锅法荧光染色与成像，全程可在24小时内完成。研究通过小鼠脑组织（30基因）、小鼠胚胎（30基因，E12.5-E14.5）及人肝癌样本（31基因，含HBV病毒探针）验证技术可靠性，解码准确率达95.7%，并整合DAPI核染色实现单细胞分割与类型注释。
研究结果
1. PRISM的编码原则
PRISM通过多通道荧光强度分级编码实现单轮高通量空间RNA成像（图1a）。其核心设计包含：针对目标基因的padlock探针含多个区段（segment），每个区段对应特定荧光通道（如Ch1: Texas Red, Ch2: Alexa Fluor 488, Ch3: Cy5, Ch4: Cy3），并通过不同序列编码强度等级（如0、25%、50%、75%、100%）。探针结合转录本后，经滚环扩增（RCA）产生重复条形码序列（图1b）。成像探针由标记荧光与未标记的"孪生探针"按预设比例混合，通过竞争性杂交形成强度分级信号（图1c）。
为消除扩增产物尺寸差异导致的编码混淆，PRISM提出"半径向量过滤"策略：将条形码视为颜色空间中的向量，仅保留角度可区分的向量（图1e）。通过约束三通道总强度（Ch1+Ch2+Ch3=4）优化向量夹角，实现15个高区分度编码；加入第四通道（Ch4）后，将编码容量提升至30-plex（Ch4采用二强度等级）（图1e）。针对组织自发荧光干扰，限制Ch4（Cy3）强度等级为2级，最终在常规显微镜下单轮成像实现30基因同步检测（图1f-i），解码准确率达95.7%。
图1 PRISM编码的工作流程和原理
2. 小鼠胚胎的空间分析可实现细胞相互作用分析
利用30基因Panel对E13.5小鼠胚胎进行空间分析（图2a-d）：鉴定出表皮、骨骼肌、胃肠道等12种主要细胞类型，其中神经系统占总细胞数的39.3%，并进一步分为前脑（端脑与下丘脑）、中脑、后脑和脊髓亚区（图2c-e）。
基因共表达分析显示：脊髓区域中Hoxb8、Robo2和Stmn2显著共定位（图2f）；下丘脑中GABA能神经元标志物Gad2与转录因子Dlx1共表达，支持DLX1直接调控Gad2的假设（图2f）。空间相关性分析表明，骨骼肌与心肌细胞、胃肠道与平滑肌细胞存在协同分布（图2g）；Wnt5a⁺肢体间充质细胞（远端分布）与Tbx5⁺成纤维细胞（近端分布）空间互作（图2g,h）；Spp1⁺胰腺细胞与软骨细胞、成骨细胞直接互作，提示其参与椎间盘早期形成（图2h）。值得注意的是，94%的肝细胞形成紧密互作网络，表明E13.5阶段已建立肝小叶多细胞结构（图2j）。
图2 PRISM对小鼠E13.5胚胎进行空间剖析
3. 时空图谱说明了胚胎器官发育
通过26张连续切片（E12.5–E14.5）构建时空图谱，涵盖425万细胞（图3b）。E13.5阶段器官结构包括：视杯多层结构（Pitx2⁺角膜→Neurod1⁺外层→Stmn2⁺内层）、脊髓翼板/基板（Hoxb8⁺）、肺叶分支（Nkx2-1⁺/Tbx5⁺）、骨骼发育（Runx2⁺成骨细胞与Col11a1⁺软骨）以及心脏房室分化（Myl7⁺/Tnnt2⁺）（图3a）。发育动态显示：胰腺在E12.5出现Spp1⁺细胞簇，至E14.5扩大并分叉；肺从E12.5到E14.5体积减小而分支复杂度增加（Nkx2-1⁺/Tbx5⁺）（图3c）；后脑Wnt5a⁺细胞迁移提示背侧形态发生（图3c）；胃肠道快速发育（Cldn7⁺/Tagln⁺）。该图谱以亚微米分辨率捕获107,655,795个转录本，揭示器官形成的关键时空特征。
图3 小鼠胚胎E12.5、E13.5和E14.5的高通量空间分析
4. PRISM表现出肝肿瘤微环境的复杂组织学特征
对HBV阳性肝细胞癌（HCC）样本进行31基因（含HBV核心蛋白探针）空间分析（图4a,b）：鉴定60,329个细胞，分为12类免疫细胞（B/T/NK/肥大细胞等）和5类非免疫细胞（图4b）。肿瘤异质性表现为：肿瘤细胞分AFP⁺、GPC3⁺、MKI67⁺亚群（图4d）；单核细胞分经典（CD14⁺CD16⁻）、非经典（CD14ᵈⁱᵐCD16⁺）和中间亚型；CD8⁺ T细胞分细胞毒性（GZMB⁺）、耗竭（PDCD1⁺/CTLA4⁺）和CXCL13⁺肿瘤反应性亚群（图4e）。
空间互作分析显示AFP高表达肿瘤细胞与浆细胞样树突细胞（pDC）、CXCL13⁺CD4⁺ T细胞共定位。区域异质性表现为：肿瘤区ROI1富集GPC3⁺肿瘤细胞，ROI2以AFP⁺为主（图4g）；正常肝区ROI5高表达HBV核心蛋白（图4h）；ROI5中耗竭T细胞增多，而肿瘤周边（ROI3–4）富集CXCL13⁺ T细胞（图4i）。
图4 PRISM对人类HCC微环境的空间分析
5. 准三维图谱在肝肿瘤中表现出微尺度基质异质性
通过20张连续切片构建准3D图谱（121.8万细胞，32类）（图5a）：CAF形成物理屏障阻碍CD8⁺ T细胞和中性粒细胞浸润至肿瘤核心，而NK细胞可穿透并在肿瘤前沿聚集（图5b,c）。空间模块分析显示：肿瘤区域存在3种肿瘤富集模块空间交错（图5f）；非肿瘤区域中性粒细胞与EPCAM⁺上皮细胞共定位（图5g）；2D中孤立的B细胞簇在3D中连接成淋巴网络，内部富集CD4⁺/CD8⁺ T细胞和浆细胞，但缺乏生发中心结构（图5h）。该发现揭示CAF介导的免疫浸润屏障及肿瘤核心-边缘的免疫响应差异。
图5 通过PRISM连续分析对HCC微环境进行准3D图谱重建
6. 大规模3D原位分析揭示了完整厚组织中亚细胞RNA分布的异质性
PRISM应用于100 μm厚小鼠脑切片（图6a）：通过脂质去除和碘海醇折射率匹配提升光穿透性，利用信号比率解码降低光学衰减影响。单轮成像鉴定皮质、海马、丘脑和下丘脑区域20余种细胞类型，保留亚细胞RNA定位信息（如神经元突触区域Stmn2分布）。三维细胞图谱覆盖皮层（207,115转录本）、下丘脑（214,671转录本）、丘脑（156,368转录本）及海马（650×650×100 μm）等区域，避免多轮成像导致的样本形变与对齐误差。
图6 完整小鼠脑组织中的3D RNA原位染色
7. 研究讨论与结果
PRISM技术的核心优势在于可及性、高效性与多功能性。通过将编码容量从传统光谱通道扩展至强度维度，并利用算法解决扩增噪声问题，首次在常规显微镜上实现了单轮60+重的RNA空间成像。这一设计不仅规避了流体设备的依赖，还显著提升实验效率——例如，构建含420万细胞的小鼠胚胎三维图谱仅需3天，远快于序贯成像技术。在应用层面，研究揭示了胚胎发育中关键互作机制：如脊髓区Hoxb8/Robo2/Stmn2共表达、肝细胞94%的邻近互作（预示肝小叶早期形成），以及Wnt5a⁺与Tbx5⁺细胞在肢体发育中的空间协同。
在临床方向，PRISM解析了肝癌微环境的异质性壁垒：癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过物理屏障阻碍免疫细胞浸润，且HBV病毒RNA在肿瘤边缘富集。这为靶向CAF的免疫疗法提供了新依据。此外，技术兼容100μm厚脑组织切片，证实其在三维样本中的适用性。未来，PRISM可通过增加强度分级或优化探针设计进一步提升多重性。其开源算法与常规设备兼容性，有望推动空间转录组技术在病理诊断、药物筛选及发育动力学研究中的普及。
教授介绍
郑春红博士，北京大学国际癌症研究院研究员、助理教授、北京大学肿瘤医院双聘助理教授，博士生导师，北京大学博雅青年学者，入选国家级海外人才计划青年项目。郑春红博士于2012年在北京大学获得博士学位，随后在北京大学和美国普罗维登斯癌症研究院从事博士后研究。长期聚焦于单细胞肿瘤免疫组学研究，在Cell，Cancer Cell，Nature Medicine等国际著名杂志发表论文10余篇。课题组未来的工作将聚焦于单细胞肿瘤免疫组学和新型肿瘤免疫疗法开发的研究。主要方向：1）肿瘤免疫微环境的单细胞组学解析；2）基于大数据的肿瘤免疫逃逸的机制研究；3）肿瘤免疫治疗新策略开发。
黄岩谊，北京大学教授、博士生导师。1997年获北京大学化学专业学士学位，2002年获该校无机化学博士学位，师从黄春辉院士。2002年至2005年在美国加州理工学院应用物理系、2005年至2006年在斯坦福大学生物工程系从事博士后研究，2006年回国任北京大学工学院助理教授，2013年晋升教授。现任北京大学工学院材料科学与工程系教授，北京未来基因诊断高精尖创新中心副主任、研究员，北京大学生物医学前沿创新中心研究员，北京大学-清华大学生命科学联合中心研究员，兼任中国化学会生物物理化学专业委员会副主任等职。
黄岩谊主要从事单细胞分析化学、微流控芯片及高通量基因组测序技术研究，主持开发纠错编码（ECC）测序法，实现DNA测序原始准确率提升。曾参与创建北京大学生物医学前沿创新中心，开发SPRINTseq和PRISM技术用于空间转录组分析。主持国家杰出青年科学基金，获国家自然科学二等奖（2003年，第四完成人）、全国优秀博士学位论文（2004年），2014年当选英国皇家化学会会士。
参考文献
Chang, T., Zhao, S., Deng, K. et al. High-plex spatial RNA imaging in one round with conventional microscopes using color-intensity barcodes. Nat Biotechnol(2025).
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