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STAT3相关通路及其抑制剂、降解剂研究进展

爱思益普

2022-10-21

背景介绍

信号转导和转录激活因子(STAT)最初作为DNA结合蛋白被发现，可介导干扰素依赖性基因表达。哺乳动物STAT家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6，它们介导多种细胞内信号通路。其中，STAT3参与了细胞的增殖、存活、分化和血管生成等多种生物学过程。在正常细胞中，STAT3的瞬时激活(主要是通过磷酸化)将质膜上的细胞因子和生长因子受体的转录信号传递到细胞核^[1]。然而，STAT3在大多数人类癌症中变得过度激活，通常与不良的临床预后有关。

作为一个转录因子，STAT3调控一系列与癌细胞生存、增殖、血管生成、侵袭、转移、耐药性和免疫逃避有关的基因^[2]。因此，靶向 STAT3 信号通路已成为许多癌症的有希望的治疗策略。本文系统的讨论了STAT3相关通路及其抑制剂、降解剂研究进展。

STAT3结构域及信号通路

1.1 STAT3的结构及功能

STAT3是一个由770个氨基酸组成的蛋白质，具有6个功能保守结构域：
1）氨基末端结构域(NTD)，用于STAT蛋白与多个共同DNA位点的协同结合；
2）螺旋卷曲结构域(CCD)，用于向受体募集STAT3以及随后的磷酸化、二聚化和核转位；
3）DNA结合结构域(DBD)，用于识别和结合特定的共同DNA序列；
4）连接结构域(Linker)，用于连接DBD和SH2；
5）SRC同源2结构域(SH2)，用于募集和激活STAT3分子，通过与相对亚基中的磷酸化酪氨酸残基相互作用来实现STAT3分子的二聚化；
6）羧基末端反式激活结构域(TAD)。如图1所示。在STAT3结构域中，SH2是高度保守的STAT结构域，其通过与特定的磷酸酪氨酸基序结合，在信号转导中起着至关重要的作用^[3]。

图1 STAT3结构域示意图^[4^]

在未受刺激的细胞中，STAT3受到负调节因子的严格调控，包括活化STAT蛋白抑制剂(PIAS)、细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)家族、蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP1、SHP2、PTPN1、PTPN2PTPRD、PTPRT和dusp22)和泛素酶^[5]，以维持细胞质中的不活跃状态。

1.2 STAT3的信号通路

STAT3是通过几种细胞因子激活的，包括白介素6(IL-6)和白介素10(IL-10)，以及生长因子^[6-7]（如表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和胰岛素样生长因子(IGF)）。一旦这些因子与其相应的受体结合，Janus激酶(JAK)就会被激活^[8]。STAT3通过2个单体之间的相互SH2结构域-磷酸酪氨酸相互作用形成同源二聚体，并转移到细胞核中，从而在细胞质和细胞核之间交换信号，来介导免疫抑制、血管生成、转移、增殖和生存的信号通路。当pSTAT3移位到细胞核中时，它与包括p68在内的一些共激活因子形成一个复合体，并结合到靶基因的启动子区域来激活它们的转录^[9]。

图2为肿瘤细胞中经典的IL-6/STAT3信号通路。IL-6与膜结合的IL-6受体α(IL-6R)和IL-6受体β(也称为gp130)结合。IL-6/IL-6R/gp130复合体激活JAKs的磷酸化，继而激活STAT3。其他生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)和表皮生长因子(EGF)也可以通过与其同源膜受体结合而使STAT3磷酸化。然后，磷酸化的STAT3形成同源二聚体，并移位到核内，与靶基因的启动子区域结合，激活靶基因转录^[10]。

图2 IL-6/STAT3信号通路^[11]

除磷酸化外，其他翻译后修饰如乙酰化、甲基化、泛素化、SUMO化和谷胱甘肽化，都与STAT3转录活性、二聚化、核易位、与核共激活因子的复合物形成和降解有关，从而为癌症中STAT3的过度磷酸化增加了另一层复杂性。

STAT3 抑制剂研究进展

STAT3可在多种人类肿瘤中被激活，在多种患者来源的肿瘤组织样本中观察到STAT3过表达。大量的累积证据有力地支持使用抑制剂或敲除系统阻断STAT3激活可以作为癌症和其他人类疾病的有吸引力的治疗靶点^[12]。STAT3抑制剂的抗肿瘤机制主要有两种:一是阻断STAT3上游通路。二是直接作用STAT3蛋白本身。

2.1 抑制STAT3上游信号

抑制STAT3激活的一个有效策略是抑制上游组分，主要集中在抑制JAK、Src和受体酪氨酸激酶（RTK）方面。

JAK是STAT3最重要的上游信号因子，在某些应激反应条件下，一些细胞因子与相应的受体结合，诱导JAK磷酸化，从而使STAT3活化。

Src是一种与细胞膜相关的非受体酪氨酸激酶，在肿瘤细胞的增殖、迁移和分化过程中发挥关键作用。在分子水平上，Src诱导酪氨酸残基磷酸化从而使STAT3活化。

RTK 可与一些受体结合，使自身发生磷酸化，从而诱导STAT3激活。RTK的受体包括表皮生长因子受体（EGFR）、成纤维细胞生长因子受体（FGFR）、人类表皮生长因子受体2（HER2）、肝细胞生长因子受体（HGFR）、血小板衍生生长因子受体（PDGFR）、血管生长因子受体（VEGFR）和胰岛素样生长因子受体（IGFR）等^[13]。

因此，STAT3的间接抑制剂与这些组分相互作用，抑制 STAT3 的激活，进而导致STAT3调控基因表达失败。

2.2 STAT3直接抑制剂

直接靶向STAT3的最常见的方法是通过破坏SH2、DBD、NTD、Tyr705以及 N端的结构域从而阻断STAT3的磷酸化、二聚化、核转移以及 STAT3 靶基因的表达。一般说来，STAT3的直接抑制剂可以分为3类：肽类、寡核苷酸类和小分子类。

多肽类药物通常是根据STAT3蛋白中氨基酸残基的结构设计的，可以针对不同的结构域。磷酸肽抑制剂PY*LKTK来源于STAT3 SH2 结构域的结合肽序列，是首次成功地破坏STAT3二聚化的尝试^[14]。然而，由于肽类药物细胞通透性差，体内不稳定，目前其临床应用的进一步开发受到限制。

寡核苷酸是针对STAT3靶标的一种新的治疗策略。与 STAT3 结合的诱饵寡核苷酸可以隔离STAT3，从而减少其与靶基因内同源 DNA 位点的结合^[15]。反义寡核苷酸（ASO）旨在通过靶向 STAT3 mRNA 来阻断 STAT3 的活性。

小分子 STAT3 抑制剂可与 STAT3 的不同结构域相互作用，抑制 STAT3 的激活和功能。口服小分子化合物 HJC0152 通过抑制 Tyr705 残基的磷酸化使 STAT3 失活^[16]。

表1 代表性STAT3上游信号抑制剂与STAT3直接抑制剂^[17]

通过各种研究及筛选，研究人员已经发现了许多STAT3的相关抑制剂，尽管这些抑制剂在体外表现出很好的物理化学性质，但因为其水溶性和细胞通透性较低，它们中的大多数临床疗效并不理想。

2.3 STAT3抑制剂在HER2乳腺癌中的应用

STAT3在多种肿瘤中持续激活，包括40%的乳腺癌。研究证实人表皮生长因子受体(EGFR/HER/ErbB）家族及血管内皮生长因子受体(VEGFR)的酪氨酸激酶（RTKs)可激活STAT3信号^[18]，STAT3是HER家族受体信号通路的中心节点^[19]。HER家族的第二个成员HBR2/ErbB是一种促癌基因，在25-30%的乳腺癌患者中高表达，基于对临床样本和乳腺癌细胞模型的研究发现HER2影响了STAT3的激活,在临床样本中同时观察到HER2的过表达与STAT3的持续激活^[20]。

目前人重组的单克隆抗体曲妥珠单抗作为靶向治疗HER2阳性乳腺癌的药物已获得FDA的批准用于临床，尽管曲妥珠单抗目前被认为是肿瘤学中最有效的治疗方法之一，但大量HER2阳性患者在治疗一年后表现出对曲妥珠单抗的耐药性^[21]。最近的研究证实HER2+乳腺癌中曲妥珠单抗耐药的发生与STAT3的持续激活有关，图3阐述了FN/EGF/IL-6-STAT3-MUC1/4正反馈环介导的曲妥珠单抗相关的耐药机制。多种信号通路介导STAT3活化，活化的STAT3也促进FN、EGF和IL-6的表达从而形成一个正反馈环持续维持STAT3信号，并上调下游靶基因MUC1和MUC4的表达，分别通过维持HER2活性和形成空间位阻阻止曲妥珠单抗的结合导致了HER2下游信号通路，特别是PI3K/AKT信号通路的的持续活化，最终介导了曲妥珠单抗的耐药。

图3 STAT3反馈激活回路介导曲妥珠单抗耐药机制^[22]

也有研究发现，曲妥珠单抗联合应用STAT3抑制剂可显著提高HER2阳性肿瘤患者的治疗效果，通过siRNA介导的基因敲除或小分子抑制剂S3I-201抑制STAT3，普遍使曲妥珠单抗治疗敏感的曲妥珠单抗耐药细胞在体内外显著抑制肿瘤生长^[23]。STAT3抑制与曲妥珠单抗联用具有良好的抗增殖和抗肿瘤作用，与其在体内外促进细胞凋亡和降低AKT磷酸化的能力一致。此外，在曲妥珠单抗敏感的亲代细胞中，添加STAT3抑制剂也比单独使用曲妥珠单抗导致更大幅度的反应^[24]。图4阐述了EN/EGE/IL-6-STAT3-MUC1/4正反馈环介导的曲妥珠单抗相关耐药对应的治疗策略。

图4 STAT3反馈激活回路介导曲妥珠单抗耐药的治疗策略^[22]

多项体内外实验证明了靶向STAT3的小分子抑制剂打破了STAT3激活介导的曲妥珠单抗耐药，使细胞重新获得对曲妥珠单抗治疗的敏感性，并对联合用药的毒副作用做了初步探索，为全面了解曲妥珠耐药机制和临床应用提供了实验依据。

STAT3 降解剂研究进展

近年来,蛋白质降解靶向嵌合体（proteolysis targeting chimeras, PROTACs）作为一种新型靶向治疗方式成为人们关注的焦点,因为它既可以抑制靶蛋白的功能，又可以阻断靶蛋白的增加。PROTACs是一类双靶点嵌合体分子,由3个部分组成:靶向结合目标蛋白的配体、招募E3泛素连接酶的配体以及两者之间的连接链。它能将目标蛋白与E3泛素连接酶的距离拉近,利用细胞内固有的泛素-蛋白酶体系统选择性诱导目标蛋白降解。与传统的小分子抑制剂相比,PROTACs在药物的剂量、选择性、耐药性以及调节"不可成药靶点"等方面具有潜在优势。

王少萌教授团队研制的小分子SD-36，其为STAT3的选择性降解剂。SD-36含有2个官能团：STAT3 SH2结构域的小分子结合体（SI-109）和Cereblon（CRBN）E3连接酶的配体（来那度胺）。当SI109与STAT3的SH2结构域结合后，CRBN被招募，而CRBN又招募E2酶来促进STAT3的泛素化。泛素化的STAT3则以蛋白酶体降解为目标^[25-26]。

图3 PROTAC 介导的 POI 泛素化和蛋白酶体降解的过程^[27]

研究中评估了SD-36在急性髓系白血病(AML)细胞系MOLM-16和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)细胞系SU-DHL-1中降解STAT3蛋白的能力，如图4所示。SD-36能有效的选择性的降低MOLM-16、SU-DHL-1中STAT3蛋白水平，且不会降解细胞中其他STATs。表明SD-36是一种有效的STAT3降解剂，与其他STAT家族成员和细胞中>5,000个非STAT蛋白相比具有特殊的选择性。研究中也证明了SD-36能显著降低MOLM-16和SU-DHL-1中STAT3的DNA结合活性及STAT3的转录活性，如图5所示。

图4 SD-36对MOLM-16和SU-DHL-1细胞中STATS家族中各蛋白的降解能力^[26]

图5 SD-36对MOLM-16和SU-DHL-1细胞中STAT3的DNA结合活性及STAT3的转录活性影响^[26]

研究中还使用小鼠异种移植肿瘤模型评估了SD-36的治疗潜力。对携带MOLM-16肿瘤的SCID小鼠进行静脉注射治疗，对其肿瘤裂解物中STAT3及pSTAT3（Y705）进行了评估，如图6所示。结果表明，SD-36在体内选择性地降解STAT3，单剂量的SD-36在诱导小鼠异种移植肿瘤中的STAT3降解方面实现了持久的PD效应，并且能够在耐受良好的给药方案下测试的所有三种异种移植模型中实现完全和持久的肿瘤消退。

图6 对携带MOLM-16肿瘤的SCID小鼠静脉注射SD-36 检测STAT3及pSTAT3（Y705）^[26]

总的来说，SD-36是一种有效的、选择性的STAT3降解剂，能够在多种异种移植模型中实现完全的肿瘤消退。在未来的研究中，PROTAC 可作为开发有效 STAT3 抑制剂的一个新思路——其既可以抑制靶蛋白的功能，又可以阻断靶蛋白表达，这种双重功能使其具有强的药效和更高的选择性，可以克服一般 STAT3 抑制剂临床疗效有限、且存在一定毒副作用的问题。

总结

作为众多致癌信号通路的汇聚点，STAT3在调节抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用。STAT3在肿瘤生态系统中的癌细胞和非肿瘤细胞中都被广泛激活，在抑制关键的免疫激活调节因子的表达和促进免疫抑制因子的产生方面发挥着重要作用。因此，靶向STAT3信号通路已成为治疗多种癌症的一种有前途的策略。

爱思益普生物团队已经建立了STAT3体外酶学筛选平台，下图为ELISA结果图，通过ELISA的方法检测了Tofacitinib（托法替尼，一种JAK抑制剂）和BNS986165（一种Tyk2变构抑制剂）对IL-6、IL-10、INFα介导的pSTAT3的抑制作用，为高通量筛选STAT3抑制剂提供了平台。（数据来自ICE）

除此之外，爱思益普生物团队还可以通过Western Blot、qPCR、In-cell-Western等技术精确分析STAT3靶点、突变位点和不同细胞的耐药性，可以高效的评价新型化合物对于STAT3的抑制作用或者降解效果。同时构建了HeLa-STAT3-HiBiT细胞系可以通量的筛选STAT3的降解剂。

（数据来自ICE）

爱思益普致力于建立全面的靶点筛选和体外生物学研究平台，结合项目具体需求，建立一系列基于生物学和药理学的研究技术集群，为客户提供涵盖各种靶标和疾病领域的新药研发服务。打造创新型CRO+的探索者。爱思益普关注新药研发企业对速度、效率和结果的需求，用专业的技术和高效的沟通帮助客户提高新药研发的效率。

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