hERG（human Ether-à-go-go-Related Gene）编码的快速激活延迟整流钾通道是参与心肌动作电位3期复极的重要离子通道[1]。研究发现药物阻断hERG钾离子通道会延迟心脏动作电位复极，进而可能诱发致命性尖端扭转室性心动过速（Tdp）。据统计，约25-40%的先导化合物都显示出不同程度的hERG相关毒性，化合物对hERG钾通道的作用已是临床前评价化合物心脏安全性的关键指标。很多药物因为导致QT间期延长风险而被撤出市场[2]。为此，国际人用药品注册技术协调会（ICH）颁布了关于临床前药物心脏毒性研究的指导方案S7B。ICH S7B 指导原则明确指出，体外hERG检测是药物性心律失常风险倾向评估的替代方法。
在hERG试验中，常规实验中采用标识浓度带入到浓度-效应曲线，由于化合物本身的吸附性、稳定性、溶解性等问题导致的化合物浓度损失，会使得使用标识浓度得到浓度效应曲线产生的IC50有较大偏差，进而影响hERG风险的评估和安全阈值的计算。因此需要检测作用于在细胞上的真实浓度，另外在ICH E14/ S7B Q&As最佳实践中也明确指出使用经过验证的分析方法来检测cell chamber中作用在细胞上的药物浓度，如果标识浓度和检测浓度有较大的差异，需要将检测浓度带入浓度-效应曲线拟合得到IC50和Hill coefficient值[3]。
图片来源于ICH E14/S7B Implementation Working Group:Clinical and Nonclinical Evaluation of QT/QTc Interval Prolongation and Proarrhythmic Potential Questions and Answers。
爱思益普时刻追踪最前沿的政策要求，已经构建了hERG（其他ion channels也可检测）试验中供试品分析研究平台，也承接了许多申报及非申报项目研究。根据以往的项目经验，我们在本篇文章列举了供试品分析对hERG结果准确性影响的典型案例，ICE专业人员在此做了详细解答，希望对大家有所帮助。
Q1: 我们想了解一下hERG通道电生理试验的检测方法及试验的具体步骤，能具体给我们说一下吗？
采用手动膜片钳技术和过表达细胞系评价候选药物对hERG钾通道电流的影响。它不仅能够提供高质量的数据，且能够根据每个化合物不同的结合特性调整给药时间，力求达到准确的阻断效应。手动膜片钳技术是研究离子通道的金标准。
常规hERG检测，我们会预先于微型离心管中（图A）配制供试品母液并在-20℃保存，在hERG试验当天，使用配制好的母液梯度稀释成中间液，再将中间液溶于hERG细胞外液中(图B)配制成工作液，将工作液放置于储液器中，进行电生理检测(图C)
图片来源于E14/S7B Questions and Answers: Clinical and Nonclinical Evaluation of QT/QTc Interval Prolongation and Proarrhythmic Potential Training Materials.
Q2: 什么叫供试品（浓度）分析，做它的意义是什么？原先我们没做供试品（浓度）分析，试验测的结果对评价有什么有影响吗？
供试品分析是指对（使用供试品）配制的给药制剂的浓度、均一性及稳定性进行测定，分析前需要对分析方法进行详细的验证，验证内容主要包括：线性，精密度和准确度，灵敏度，特异性，残留，稳定性等[4]。
在hERG试验中，未进行供试品分析验证浓度时，我们通常将标识浓度带入浓度-效应曲线拟合得到IC50。进行供试品分析后，检测出受试物配制的准确性及作用在细胞上的真实浓度，将真实浓度带入浓度-效应曲线拟合得出的IC50。对于一些吸附性较大或稳定性不好的药物，会导致理论浓度与测定浓度相差较大，进而影响hERG风险的评估和安全阈值的计算。
Q3:我们通过邮件收到贵公司检测的结果，发现有些化合物的测定浓度与标识浓度（配制浓度）有较大的差距，具体原因是什么呢？
们查阅资料及做了大量的试验，研究发现：化合物浓度在hERG试验中存在损失，其中损失的原因包括：
（1）化合物的稳定性
（2）化合物的溶解性
（3）化合物本身或在给药系统中存在吸附性。这种现象时有发生。这是化合物的测定浓度与标识浓度（配制浓度）有较大的差异的直接原因[5]。
探究影响制剂浓度发生变化的真实原因对制剂的配制方法、配制材料、放置时间和条件、给药系统等的优化，具有指导作用。优化和改善我们的试验条件能够减少hERG试验IC50的测定误差，尽管如此，试验系统中仍存在无法取代的部分（如给药系统中的硅胶管路存在吸附作用），所以在hERG试验中浓度损失无法根本消除，需要加入供试品分析得出真实浓度，为临床前心脏安全评价中发现的问题提供可靠的科学参考。如果供试品存在问题，安评的结果可能失去了技术评价的价值，甚至可能误导新药的后期开发。鉴于供试品检测对于新药安全性评价具有重要意义，应该在安全性评价试验中进行供试品分析。
图片来源于Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 59(2009) 29-34
Q4:我们的药物溶解度很好，为什么到贵公司检测时，出现溶解度很差的现象呢？遇到这种问题，你们是怎么样解决的呢?
药物在DMSO或乙醇有机溶剂中溶解性较大，在电生理试验中，药物必须溶解在细胞外液中，细胞外液属于是生理缓冲溶液（pH=7.2–7.4），盐浓度高，离子强度大，成分复杂。因此许多药物在细胞外液中溶解度非常有限，所以经常会出现沉淀的现象。基于这些情况，我们团队具有丰富的经验来解决这些专业问题，给您提供可靠的科学参考。
检测服务的内容如下：
结语：
针对客户所关注的热点问题，本文做了详细的解答，在hERG供试品分析中，一直因为制剂中的离子抑制效应使得供试品分析达不到试验质控要求。这个难题一直困扰许久，经过我们不断试验的验证，得出一套检测hERG（其他ion channels也可检测）试验中供试品分析的方法，同时也解决一些受试物由于稳定性差、溶解度低和通过给药系统后有较大损失等问题，最终得到更加准确的数据。国际人用药品注册技术协调会（ICH）的指导原则S7B描述了新药研究所需的临床前安全测试，尤其把药物对hERG的IC50的测定作为核心的安全性检测指标。加入供试品检测得出真实浓度，为临床前心脏安全评价中发现的问题提供可靠的科学参考。
[1] Alexandrou, A. J., Duncan, R. S., Sullivan, A., Hancox, J. C., Leishman, D. J.,Witchel, H. J., & Leaney, J. L. (2006). Mechanism of hERG K+ channel blockade by the fluoroquinolone antibiotic moxifloxacin. British Journal of Pharmacology, 147(8),905–916.
[2]Pharmacological and Toxicological Methods, 59(1), 29–34. https://doi.org/10.1016/j.vascn.2008.10.004
[3] ICH E14/S7B Implementation Working Group:Clinical and Nonclinical Evaluation of QT/QTc Interval Prolongation and Proarrhythmic Potential Questions and Answers.
[4] White Paper: Non Clinical Dose Formulation Analysis Method Validation and Sample Analysis, AAPS Journal, Vol.12, No. 4, December 2010.
[5] Brimecombe, J. C., Kirsch, G. E., & Brown, A. M. (2009). Test article concentrations in the hERG assay: Losses through the perfusion, solubility and stability. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 59(1), 29–34.
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