观点：非全面取代，但可寻求替代或减少方法
动物试验已有逾一个世纪的历史，现代科学研究中其应用始于19世纪，用于疫苗研发等领域。1938年美国通过《联邦食品、药品和化妆品法案》（Federal Food, Drug, and Cosmetic Act），使动物毒性测试成为强制性要求，这在全球形成了规范性基础。
例如，1937年因“磺胺酏剂灾难”（Elixir Sulfanilamide disaster，致107人死亡）推动了该法案的出台。
非动物替代方法兴起
由于传统动物试验费用高昂、耗时长，且与人体生理特点并非完全一致，近年来非动物测试方法得到了政策和技术层面的双重支持。
3Rs原则的驱动与全球监管变化
3Rs原则（替代、优化和减少动物使用）激励各国政策改革及新测试方法的发展，如EMA和FDA的指导文件均表明支持非动物方案的使用。欧盟全面禁止动物试验的化妆品政策（1998年英国落实化妆品动物测试禁令；2011年欧盟全面禁止化妆品进行动物测试），并推广至印度、加拿大等国。美国通过《FDA现代化法案2.0》（FDA Modernization Act 2.0，2023年），成为全球首个废除药物动物试验强制要求的国家，允许使用经验证的非动物方法直接进入人体试验。如体外试验（in vitro）及计算机建模（in silico）成为了人类毒性检测的替代重点。
新方法学（New Approach Methodologies，NAM）的应用
用于替代动物试验的非动物测试方法，关注体外模型。如人体相关细胞或组织培养、3D打印的“器官芯片”。计算机预测模型，如QSAR模型（Quantitative Structure-Activity Relationship QSAR models）和不良结果通路（Adverse Outcome Pathways，AOPs），以高效整合毒性数据，构建更加人类相关的分析。全球机构如OECD开展整合型测试与评估方法（Integrated Approaches to Testing and Assessment，IATA）工具的开发；ICH的统一标准化工作正推动这类方法成为全球化要求的一部分。
但目前，区域间缺乏统一的监管规则；如何验证替代方法的可靠性、适用范围与标准化问题成为替代试验应用的主要障碍。动物试验的减少并非一蹴而就，尽管科学家致力于开发更加人类相关的方法，但过去积累的大量数据和现有法规仍然依赖动物毒性数据。以更快速度、更高效率提供可信的人类毒性数据；若全球监管机构能加速批准NAM方法，将进一步推动3Rs原则的全面实施。国际间标准化方法的建立有助于避免因地区差异造成的药物开发障碍，同时加速NAM的全球接受度。通过政策和技术的双轮驱动，药品研发在伦理与效率之间正逐步实现平衡。未来，非动物测试方法（NAM）有望逐渐取代传统动物试验，为药品开发注入新的生命力。
3Rs原则的提出与意义
3Rs原则（替代、减少、优化）由英国科学家William Russell和Rex Burch于1959年在著作（The Principles of Humane Experimental Technique）中首次提出。其核心目标是减少动物在科研和测试中的使用，同时提高伦理性和结果的可靠性。随着时间推移，3Rs原则逐渐被科学界广泛接受，但在不同国家、机构和研究者的实际实施中存在差别。英国是最早立法规范动物试验的国家之一（1876年虐待动物法案Cruelty to Animals Act），此后多个国家和地区将3Rs原则纳入相关法规和指导方针。
欧盟对3Rs原则的支持
欧盟颁布了Directive 2010/63/EU（2010年），强调采用非动物方法进行科学研究，协调并提升了动物福利标准。该指令更新了1986年版本，明确将3Rs原则作为科学研究和动物使用领域的核心要求。
ICATM的作用
国际替代测试方法合作组织（International Cooperation on Alternative Test Methods，ICATM）联合了多个国家（日本、加拿大、韩国、巴西、中国、英国等）和机构（如European Union Reference Laboratory for alternatives to animal testing，EURL ECVAM、Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods，ICCVAM），旨在推动测试方法的独立验证及审查。其目标是通过协调验证研究，统一替代方法的国际监管标准，帮助药企完成全球申报。
设立机构与区域支持
各地区为推行3Rs原则成立了一系列专门机构：如英国的NC3Rs（National Centre for Replacement and Reduction of Animals in Research）；挪威的NORECOPA（Norwegian Consensus-Platform for Alternatives）；芬兰的FICAM（Finnish Centre for Alternative Methods）；丹麦和瑞典的3Rs中心（3Rs Centres）。美国的约翰霍普金斯替代动物试验中心（John Hopkins Center for Alternatives to Animal Testing，CAAT）。
为替代方法获得监管认可，需确保验证方法的科学有效性、一致性和全球适用性。通过如ICATM和EU-NETVAL（European Union Network of Laboratories for the Validation of Alternative Methods）这样的多边合作组织进行协调和标准化。包括器官芯片、计算机建模等在内的新技术，正在为减少和替代动物试验提供更具体的解决方案，但仍面临技术进展、验证流程和国际监管认可的挑战。
ICCVAM与NICEATM的作用
ICCVAM于美国国家毒理学计划（NTP）的替代毒理方法评估中心（National Toxicology Program’s Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods，NICEATM）框架内运行。主要任务是开发和验证新方法学（NAMs），以替代传统动物测试，推广3Rs原则。
行动路线图四大核心要素：定义测试需求；识别现有替代测试及计算模型；开发整合性测试与评估方法和应对科学、监管及国际协调相关的挑战。路线图聚焦急性全身毒性（acute systemic toxicity）、眼及皮肤刺激性、皮肤致敏性等领域。推动替代测试方法满足美国联邦机构要求，同时最大程度推广3Rs原则。
政策与法律推动替代方法
2022年12月，美国通过支持替代毒理测试的新法案，为药物提交采用非动物测试方法开辟了道路，同时并未完全禁用动物试验。该法案促进了以人类生物学为中心的体外模型开发，被视作更精准和相关的毒性测试手段。这样的立法改革具有两大意义：减少动物使用（包括非人灵长类动物），改善动物福利；降低动物试验的伦理和经济成本，同时提升数据可靠性。
动物测试耗资巨大，但结果往往因人与动物间生理差异难以直接外推至人类。文章探讨了动物试验在药物毒性预测中的局限性。尽管长期以来动物试验被用于评估药物的人体毒性，但研究表明其可靠性有限，结果与人体试验往往不一致，导致高失败率以及资源和时间的浪费。此外，动物试验还可能导致毒性药物误被认为安全，或有潜力的药物被错误淘汰。作者呼吁重新审视这种传统方法，并推广更可靠的替代方案，如体外测试、计算建模和器官芯片技术，以提高药物开发的效率和安全性。
3Rs原则在当前研究中的价值
过去几十年，3Rs原则推动了更为复杂且人类相关的研究工具的开发，如组织工程、计算机模拟（in silico）及体外技术（in vitro）。按照3Rs原则进行研究，不仅提高了数据质量，还维护了伦理标准。替代方法能够以更低的成本、更少的人力，快速提供高质量数据。NC3Rs现代策略，实施了所有3Rs组成部分，不仅改善了动物福利，也提高了临床前数据的质量，满足监管要求。
3Rs原则从概念到实践的发展得益于UFAW创始人Charles Hume打造的非对抗式合作模式，以及科学界的深入参与。这些原则强调在实验中减少对动物的使用与伤害，并通过更好的设计与技术提升科学结果的可靠性。虽然它在全球被广泛接受并纳入立法，但其实施仍面临地区性差异和新研究领域带来的挑战。未来，教育、投资和持续关注将是推动3Rs原则进一步普及和改进的关键。
美国、欧盟等国家推动应用替代方法，但动物试验仍然没有完全被禁止，这是目前毒理测试改革的主要限制之一。科学家的目标需超越传统3Rs的理念，利用现代科技（如AI和体外芯片）推动毒理研究进入全新阶段，使3Rs原则更具吸引力、更易被全球研究界和监管机构接受。
替代（Replacement）
替代旨在寻找可靠的非动物试验方法来模拟人类生理特性，从而减少实验动物的使用。实现替代的方法包括：使用体外（in vitro）或计算机建模（in silico）方法。如人体组织和细胞试验：通过人体源组织、细胞进行毒性测试。低等替代模式生物：比如果蝇（Drosophila melanogaster）、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）。
体外技术包括：复杂细胞培养体系：干细胞技术、3D组织工程等；类器官/器官芯片（organ-on-chip）：允许在体外模拟人类重要器官的生理功能；微生理系统：结合3D打印技术与相关工程学，实现更加精准测试。计算机方法：通过计算建模和人工智能工具进行毒性预测。
推动替代的关键策略
测试要求的标准化：确保不再依据低效的动物试验方法制定测试标准。非动物方法应当成为新的规范。
数据共享机制：促进不同实验室之间交流已验证方法的结果，减少数据和研究的重复性。
法规调整：制定明确政策，确保在已证明有效的情况下，非动物测试方法能够取代动物试验。
替代测试方法仍需整合到传统方式中进行验证，以确保结果的科学有效性和应用广度。科学界需进一步推广和支持替代方法的开发与验证，尤其在以下领域：替代技术的标准化与可靠性验证；跨学科专家协作，推动政策与科学的联动发展；探索与推广大规模应用的性价比高的替代方法。替代策略不仅仅是3Rs原则的重要组成，也是应对药物研发技术挑战及伦理争议的关键方向。通过整合科学、伦理和法律框架的努力，替代策略可以更有效地促进药物开发中的创新与可持续发展。
优化（Refinement）
优化指通过对试验设计与环境的改进，减轻实验动物痛苦，改善生活质量，从而提升动物测试的伦理性和数据有效性。具体实践包括：使用更温和的试验方法；尽量减少动物痛苦和情绪压力（如使用合适的麻醉剂与镇痛药）；提供适当的环境丰富化（environmental enrichment），以满足动物的行为和生理需求。
动物压力与试验数据的相关性
实验动物处于压力状态时容易表现出异常的重复行为（如刻板行为），这会导致生理和行为状态的变化，从而影响试验数据的有效性和可靠性。如温度、湿度、光照、通风、噪音等条件控制不当，会让动物无法维持正常的生理稳态。压力状态下试验结果可能具有较差的重复性，并导致实验室间数据不一致。Russell和Burch曾提出：“良好的动物福利能够带来最佳的科学结果”。
环境丰富化的重要性
环境丰富化措施通过增加环境复杂性，模拟动物自然行为，提高动物生活质量，从而减少压力和异常行为。
在一项为期3周的试验中，研究人员使用丰富的环境（跑轮、玩具、隧道）饲养小鼠，结果表明，这些措施不仅降低了小鼠的压力，还提高了试验数据的可靠性和可重复性。设计适合研究需求的环境丰富化手段，可以进一步优化试验结果的质量。研究前优先设计适当的丰富化措施，已成为科学试验设计的重要因素。
转变对试验数据差异性（Variability）的认识
过去，科学界认为试验需要在“标准化”条件下进行，以尽量减少试验中的个体差异和数据波动。新的观点认为，动物群体本身是异质的，类似于人类个体差异，并非单纯的研究工具。
因此应充分理解和尊重个体需求的差异性。动物的饲养方式、环境条件、处理方式、饮食及肠道微生物群都会显著影响试验数据。改进策略包括引入如临床研究中常用的随机化与盲法设计，建立更加稳健的试验设计，减少试验偏离。
减少（Reduction）
减少（Reduction）旨在通过改进试验设计、数据共享及资源利用，最大限度地减少试验中动物使用的数量，同时保证试验结果的可靠性和科学性。通过替代技术和优化试验设计，避免不必要的重复试验，减少资源消耗并提升研究质量。应用统计方法优化试验设计以减少动物样本数量。
通过如OECD的数据互认（Mutual Acceptance of Data，MAD）机制减少重复测试；鼓励研究人员之间资源共享以避免试验数据浪费。鼓励采用更高效且结果更可靠的试验技术。
实验动物使用的全球现状
2015年，全球用于科学实验的动物数量估算为1.921亿只，比2005年的数据（1.152亿只）增加了36.9%。这项统计基于37个发布国家数据的国家，并结合142个未提供数据国家的预测模型得出。此外，自2005年以来，发布动物实验数据的国家数目并未显著增加，缺乏持续、精准的数据阻碍了替代、减少和优化（3R原则）实验动物努力的效果监测。这强调了推动全球3R原则实施及完善数据收集的重要性。
新冠病毒大流行促进了疫苗和药物研发的快速发展，其进程离不开动物实验的帮助。然而，动物实验的伦理问题及透明度仍备受争议。在德国，通过“非技术性项目摘要（non‐technical project summaries，NTS）”的数据分析可以追踪与新冠病毒研究相关的动物实验数量与用途，并发现透明化对于公众与科学界了解动物实验的重要性。同时，该研究探讨了用于新冠病毒研究的动物模型选择中的局限性以及对三大原则（替代、减少与改良）的重视。
欧盟2020年实验动物使用量为7,938,064只，美国估计1200万到2400万。如英国在2021年进行了3.06百万次活体动物的科学试验程序，较2020年增加了6%，但比2004年减少了15%。
美国的动物权益组织PETA报告，仅在美国，每年超过1.1亿只动物用于医学研究以外的试验，包括教育培训、毒性测试等。
可减少动物使用的原因
大量临床前研究的结果无法直接套用于临床试验。动物体与人类生理之间的差异可能导致试验结果误差，降低数据的可转化性。
Baker调查中，90%科学家认为试验结果重现性低于50%。原因多为原始数据质量低下和试验设计不规范。
ARRIVE指南：发展可靠的试验规范以提高数据的透明性与重现性，指导如何进行动物试验报告。
试验设计助手（EDA）：NC3Rs提供的一款在线试验设计工具，帮助科学家开发稳健的研究设计，高效地获取可靠和可重复的研究结果。
替代动物试验的方法（Alternatives to Animal Testing）是药物毒理学测试和临床前研究的重要工具。鉴于传统动物试验在预测人类反应方面的局限性以及伦理问题，开发能够替代动物测试的新方法受到越来越多的关注。
替代测试的分类
完全替代（Full Replacement）：采用完全不依赖动物的测试系统。例如：人类相关（human-relevant）体外模型：微生理系统（Microphysiological systems）、类器官（organoids）。计算机建模（in silico）：利用计算技术模拟毒性反应。
部分替代（Partial Replacement）：使用动物组织，而非活体动物。如：动物来源组织切片或细胞培养；鸡胚试验（in ovo）。
通过替代方法，减少对动物活体使用的依赖，同时保持试验结果的可靠性和可追溯性。
替代方法的具体类型及应用
人类相关体外模型（Human-relevant In Vitro Models）
微生理系统（Microphysiological systems, MPS）：使用3D打印或组织工程技术搭建微型“器官芯片”（organ-on-chip），模拟人体特定器官功能，例如心脏、肝脏、大脑等；能够在体外环境中研究药物作用及毒性，提供更高水平的精确预测。
器官芯片（Organ-on-chip, OC）
器官芯片是一种基于微流体技术和组织工程的先进体外试验模型，能够模拟人类器官的微环境及生理功能。器官芯片的应用已拓展至多种关键器官系统，包括肝、肾、心脏等。多器官芯片通过将多个器官芯片组合，模拟全身多个器官之间的反应，如药物代谢路径或整体毒性。近年来，随着技术的进步，器官芯片已扩展至多器官芯片（Body-on-chip, BC），实现了更高水平的人体反应模拟，使其成为传统动物试验的重要替代工具。
器官芯片的优势
更高的人体相关性：器官芯片能更真实地模拟人类器官的结构、功能及复杂微环境，为药物测试及疾病建模提供了更高的生理相关性。
提高药物毒性预测能力 - 肝芯片的案例：Emulate公司开发的肝芯片对因肝毒性从市场撤回或被终止的人类试验药物，能准确预测87%的毒性结果。肝芯片未报告没有毒性的药物产生错误的阳性结果。这是一个重要发现，因为药物性肝损伤（DILI）是药物撤市的最常见原因。不使用活体实验动物，避免伦理问题，且减少动物试验需求。可研究特定人群（如肿瘤或遗传特性患者）的药物反应；对多种疾病机制进行探索，如肿瘤、感染及慢性病研究。器官芯片技术具有高效性，可以在早期预测低效或有毒的化合物，从而大幅节省药物研发的时间和成本。
器官芯片的局限性与挑战
芯片上的人造组织或器官目前尚无法完美复制完整的人体器官，部分重要细胞或功能缺失（如免疫细胞）。特定器官芯片可能难以捕捉全身性疾病（如癌症转移）的复杂生理表现。器官芯片技术尚处于发展阶段，不同实验室间的技术规范需要进一步统一，以确保结果的一致性和可重复性。虽然器官芯片模拟的微环境更接近人体，但某些功能仍受限于技术能力，难以完全外推至人体反应。初期开发和实际应用的技术成本较高，且需要技术人员掌握特定的专业知识。
计算机模拟（In Silico）
计算机模拟是替代动物试验的重要方法之一，其在药物发现及毒性研究中的价值愈发显著。通过计算技术预测药物特性和毒性，不仅能够提高效率，还可以大幅降低研发成本，同时减少对动物试验的依赖。在计算机或模拟环境中进行试验或其部分试验，利用复杂的数据集进行建模和预测。计算机模拟显著缩短药物研发周期，筛选早期阶段的低效或有毒化合物，避免资源浪费；可支持高通量筛选（HTS），通过大数据分析预测毒性和药物、受体互作。通过毒性预测和功能分析，减少传统动物试验的数量和复杂性。
常见方法与应用
QSAR（定量构效关系模型）：QSAR是以分子的物理化学属性为基础，预测其生物活性或毒性的数学模型。从二维（2D）模型发展到三维（3D）和四维（4D）模型。早期毒性筛查和虚拟化合物筛选；已被OECD认可，并纳入化学危害评估的QSAR工具箱。
案例包括：Nintedanib：QSAR用于评估杂质毒性，支持药物审批。Tofacitinib：QSAR方法在预测遗传毒性方面的数据与DEREK和SARAH系统一致。
分子对接（Molecular Docking）：分子对接通过预测小分子（药物）与大分子（蛋白、酶）的3D结构，相互作用及结合模式，支持药物靶点研究与筛选。高通量虚拟药物筛选；学术与工业药物研究的关键工具。
毒性预测模型
整合测试与评估方法（Integrated Approaches to Testing and Assessment，IATA）：利用高通量及高内容筛选方法，用不良结果路径（AOP）生成与解释数据。比较已知化学物质的毒性数据库，以预测化学物质毒性或副作用。一些算法在某些测试（如吸入毒性风险和水生毒性）中的准确性与动物试验相当。
In Silico方法的挑战与局限
低特异性与低命中率：高通量筛选（HTS）：通常命中率仅为0.5%~1%，对于复杂靶点甚至不足0.1%。预测结果可能产生假阳性和假阴性。例如：UCSF的研究中，对151种药物预测副作用，但46%预测为假阳性。
生理复杂性不足：缺乏对药物在人类复杂生理系统内表现的全面预测能力。
数据质量和能力：结果精度依赖于输入数据的质量，预测模型需通过大规模试验验证。例如，用QSAR方法预测细菌致突变性的假阴性率约为8.1%。
优化方向
In silico方法与体外测试方法结合可以显著提升数据准确性与实际相关性。例如，研究成功将体外试验与计算方法相结合，实现对抗心律失常药物的90%准确分类。OECD和美国FDA已发布关于整合测试方式及建模应用的指导文件，规范in silico方法的开发与应用。通过结合人工智能（AI）技术、深度学习神经网络等新方法进一步提升模型对人体复杂微环境的模拟能力。复杂毒理评估中，需毒理专家审阅计算模型结果，避免不确定性以及不一致性。
鸡胚试验（In Ovo）
鸡胚尿囊膜试验（Chick Chorioallantoic Membrane Assay, CAM）
鸡胚尿囊膜试验是一种经济高效、伦理争议较低的in ovo试验模型，作为动物试验的替代方法，正受到国际科学界的广泛关注。CAM是指鸡胚尿囊膜，源自受精鸡蛋的胚胎膜结构，具有发达的血管系统和良好的生长支持性。被广泛用于癌症研究、毒性测试、组织工程和皮肤伤口愈合研究等领域。
CAM试验不被视为动物研究（尤其胚胎发育层级低于EDD 17的情况）。CAM不含神经支配，因此试验不涉及疼痛感知。CAM模型无需特殊动物设施，且试验重复性高，适合进行大规模筛选；节省试验时间和材料用量。在EDD 18之前，CAM缺乏完整的免疫系统（如T/B细胞功能），适合研究移植肿瘤或外源性组织工程。
CAM的典型用途
癌症研究：肿瘤移植模型：通过将肿瘤球体或细胞团移植至CAM，研究肿瘤微环境、血管生成及肿瘤侵袭性。利用显微正电子发射断层显像（micro PET/CT）等设备，构建3D肿瘤图像，提高肿瘤移植试验的可重复性。
毒性试验：CAM法在测定化学物质急性毒性（如LD50值）与小鼠试验的结果非常接近，适合用于毒理学研究的初期筛选。
皮肤科与伤口愈合研究：CAM支持皮肤移植试验，可研究伤口愈合中的再上皮化、血管生成和瘢痕形成。FDA在评估针对慢性皮肤溃疡及烧伤创口治疗的药物时，已将CAM模型纳入指南。
组织工程与再生医学：CAM被用作骨再生和软组织工程的体内研究模型，是人类组织工程研究的有力工具。
血管生成研究：CAM模型广泛用于研究血管生成以及抗血管生成药物的筛选。
CAM的试验接近脊椎动物的生理系统：随着发育过程，鸡胚CAM的血管结构和器官发生与啮齿动物的生理特性有很高的相似性。在大多数国家，试验胚龄（EDD < 17）的鸡胚被视为非动物模型，因此无需伦理审批。使用受精鸡蛋作为模型，成本极低，尤其适用于高通量筛选。
局限性：物种差异影响，鸡胚与人类在血管生成调控上的物种差异可能会限制数据的外推性。CAM模型无法反映完整免疫功能，这在某些研究（如免疫相关药物筛选）中可能是限制因素。CAM试验因鸡胚发育阶段的限制，研究时间较短，一般需要在EDD 17之前完成。
无脊椎动物（Invertebrates）
无脊椎动物在3Rs原则中的替代作用逐步被认可，它们因生物路径的保守性和伦理上的争议较小，成为传统动物试验的一种潜在部分替代（Partial Replacement）。现有科学研究表明，无脊椎动物（如果蝇、线虫及变形虫）可能不具备复杂的痛觉体验能力，因此在伦理上比高等动物试验更容易被接受。
果蝇（Drosophila）：作为遗传研究的经典模型，果蝇具有短生命周期和易于操作的基因组工具，用于研究神经生物学、毒性测试和发育生物学。
线虫（Caenorhabditis elegans, C.elegans）：这种非致病性微小圆形蠕虫，因其保存的生物学通路和完整的多细胞结构，被用于毒性测试中。
毒性预测能力：C.elegans拥有与脊椎动物相似的功能性细胞和组织，因此可以通过特定试验手段预测化学物质的毒性。
例如，美国FDA针对C.elegans已开发用于评估发育与生殖毒性的相关技术，且早期研究显示结果与人类毒性反应具有一定关联性。
Hunt等人开发的一种新型线虫发育与活性测试（wDAT），能预测重金属对发育神经毒性的影响。研究结果表明，线虫模型对一些毒性反应的检测结果与哺乳动物研究一致。此外，某些线虫繁殖功能和人类保守性较高，进一步支持通过线虫模型补充活体毒性研究的可行性。C.elegans的生物通路与人类生物学有较高的一致性；其短生命周期与快速繁殖降低了试验时间成本；易于基因编辑和遗传修改，让科学家能够快速进行大规模筛选性试验。
无脊椎动物的优势与局限
优势：无脊椎动物引发的伦理争议较少，使其成为动物福利法严格限制下的替代试验对象。与高等动物相比，线虫等无脊椎动物模型试验的经济及时间成本显著降低；代际时间短（如C.elegans的生命周期仅2~3周），能够快速获得数据。许多无脊椎动物模型具备完善的基因组和分子生物工具，方便深入研究毒性机制。
局限：无脊椎动物无法完全替代复杂脊椎动物模型，尤其无法模拟复杂的人体器官间相互作用；试验中可能缺乏特定组织或微环境的复杂性，如脑血屏障、肝脏代谢等。试验结果的泛用性与人类生理相关性需通过大量研究验证。
美国FDA通过引入无脊椎动物毒性试验，正在逐步将此类模型纳入监管测试框架。通过持续改进试验模式（如wDAT），FDA努力优先筛选有用化合物，在解决毒性评估问题的同时减少对哺乳动物的需求，降低成本并节约时间。未来，将开发更标准化的试验条件，克服不同实验室间的可重复性问题。将无脊椎动物模型与微生理系统、计算机建模等技术结合，使之成为更强大的毒性预测工具。全球监管机构（如FDA、OECD等）在政策层面推广无脊椎动物模型应用，进一步推动其成为替代动物试验的重要选择。
斑马鱼（Zebrafish）
斑马鱼是一种重要的脊椎动物模型，因其在遗传学、生物医学以及毒理学研究中的优势，成为动物试验与体外试验之间的桥梁。
斑马鱼与人类基因组具有70%的同源性，许多人类生理和疾病相关的基因在斑马鱼体内也得到高度保留。简单的基因操作技术使其容易进行基因编辑和突变试验。根据2010年欧洲委员会的指导意见，使用斑马鱼胚胎或孵化后5天以内的幼鱼不受动物研究法规的限制。这大大减少了伦理审批的复杂性。由受精到孵化周期非常短（约48~72小时），胚胎可在透明的环境中培养，便于显微观察；用量需求低，经济高效，适合高通量筛选和活体试验。斑马鱼胚胎测试已成为测定鱼类急性毒性（FET测试）的被认可体系，研究人员正在探索其替代哺乳动物生殖毒性测试的潜力。
斑马鱼的主要应用领域
毒理学与药物筛选：斑马鱼胚胎和幼鱼被广泛用于毒性筛查，包括对发育、肝脏和神经系统毒性的评估。
曼彻斯特大学使用突变基因斑马鱼幼鱼模型（5日龄）建立脑出血研究体系，探索用于中风治疗的药物筛选可能性。
斑马鱼被用于研究多种人类疾病，如骨质疏松、神经系统疾病、肝损伤等；特定阶段的斑马鱼胚胎和幼鱼可精确模拟特定病理过程，例如试验诱导脑出血模型。斑马鱼模型在研究发育突变及基因表达方面意义显著，其透明胚胎特性便于实时追踪细胞分裂和分化过程。斑马鱼具有强大的组织再生能力，如心脏、鳍和神经组织，成为再生医学领域的重要研究对象。
斑马鱼试验的局限性
斑马鱼与人类器官系统的复杂性仍存在一定差距，某些疾病或药物反应可能无法完全模拟。例如，斑马鱼的肝脏代谢功能与人体不同，某些药物毒性可能无法准确预测。斑马鱼在一些器官和组织结构的发育方式上与人类存在显著差异，可能影响某些研究的外推性。高质量试验结果依赖于完善的试验条件与仪器支持，对技术人员的操作水平有较高要求。
替代动物试验的方法大多建立在人类生物学基础之上，人类生物学相关性增强，具有更高的相关性。替代模型使用现代技术（如AI和微流体），能够在短时间内提供一致、可验证的数据。不依赖动物活体，能够降低引发伦理争议的可能性，同时减少试验后处理费用。以上替代动物测试的方法在科学研究和伦理期望之间架起桥梁。它们的重要性不仅在于减少动物使用，也在于能够解决传统动物测试在结果外推性和可重复性上的不足。替代方法需要在最小化动物使用的同时，保证结果的可靠性。考虑到整体效能，研究需兼顾3Rs原则各方面要求。
面临的挑战与未来方向
模型的标准化与一致性：当前3D培养模型和类器官试验可能存在显著的实验室间差异，难以完全标准化。未来需开发高通量和高一致性的模型系统。
改善原始组织缺陷：提高类器官的细胞多样性和分化效率，以更接近实际的组织复杂性。
结合微流体与芯片技术：微生理系统和器官芯片有望解决传统体外系统缺乏复杂血液、器官相互作用的不足，为研究全身生理和病理提供新思路。
多学科整合的潜力：整合工程学、生物学和计算技术，发展更强大的计算模型和试验平台，用于更有效地预测药物对人体的毒性及有效性。
世界主要国家3Rs原则概览
美国
国家卫生研究院（National Institute of Health，NIH）：实施减少实验动物使用的计划。FDA的新替代方法计划（New Alternative Methods Program，2022年启动）：推动体外测试和计算建模等替代方法，提升毒理学研究的效率和道德性，同时减少动物试验。基于科学进步和国际合作，通过替代技术改善药物研发和公共健康结局。
英国
NC3Rs（2004年成立）：引领新技术开发与应用，减少动物使用并改善动物福利。法规体系：《Animal (Scientific Procedures) Act》（1986）：强制要求在科研中减少动物使用。英国内政部制定了实验动物的饲养与照护守则，有效保障实验动物的福利。
瑞典（欧洲代表）
法规基础：遵循《欧洲议会2010/63/EU指令》（Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes, 2010），2013年瑞典相关立法与欧盟标准接轨。瑞典农业委员会（SBA）：发放许可证并每年检查试验设施，确保合规性与道德标准。瑞典3R中心：推广最优实践，支持替代方法的开发。
日本
法规框架：《动物人道待遇管理法》（Act on Humane Treatment and Management of Animals 1973）：要求尽量减少动物使用并优化试验方法以降低痛苦。日本科学委员会发布的指南：推荐试验机构设置专人负责动物试验管理，并由IACUC审查试验方案。
中国（大陆）
动物试验需遵守3Rs原则，试验方案需经伦理审查并获许可。2018年，中英两国NC3Rs和中华人民共和国科学技术部合作，推动科学创新以减少动物使用。中国实验动物学会（CALAS）：数据共享平台减少重复试验。过去20年，替代方法和3Rs原则的应用取得显著进步。
全球对3Rs原则的接受度提升
近年来，全球主要监管机构和国家通过立法与指导方针积极推动3Rs原则的实施，旨在减少实验动物的使用并促进基于人类细胞和组织的替代方法的开发。这些策略不仅提高了化学品与药物的安全性评估能力，还减少了动物实验的伦理争议。例如，《2010/63/EU指令》要求在监管测试的过程中优先采用基于3Rs的办法。同时，美国FDA和欧洲药品管理局（EMA）出台了一系列引导性文件，鼓励研究者和利益相关方支持3Rs方法的实施。这种趋势已扩展到英国、挪威、荷兰与美国等国家，它们制定了战略计划，逐步减少监管背景中的动物实验依赖。为实现药物开发过程中的3Rs原则，创新的非动物替代技术正受到广泛关注，包括类器官培养、器官芯片技术与计算毒理学方法等。这些替代方法已逐渐应用于一些毒性测试和药物开发中，例如体外细胞基模型和计算模拟被FDA批准用于评估药物安全性与疗效。但即便如此，动物实验仍在复杂疾病研究和新疗法的开发中占据重要地位，特别是当科学需求非常迫切时。此外，由于替代方法的开发和验证成本高昂，这也阻碍了其快速普及和全面应用。世界卫生组织（WHO）和许多国家的监管机构正在积极推动对替代方法的认可，例如WHO在2022年发布的生物类似药评估指南明确指出，如果生物类似药与其参比产品高度相似，则无需动物实验支持。此外，美国FDA现代化法案2.0允许使用细胞测试和计算模拟替代动物实验；英国MHRA和加拿大Health Canada也通过政策转变，建议不再强制进行动物实验以审批生物类似药。这种监管政策的变革不仅简化了药品审批流程，也促进了全球药物许可标准的协调与统一，从而最大限度地减少重复动物实验的需求。一些替代方法在全球药物和化学品监管领域的成功应用进一步证明了其可行性。例如，EpiDerm皮肤刺激测试被OECD采纳为国际标准，对传统Draize兔皮肤刺激试验实现了全面替代。此外，英国MHRA于2019年批准了一种由Achilles Therapeutics开发的癌症免疫疗法的人类试验，该疗法尽管缺乏动物实验数据支持，也因其相关性更接近人类需求而获得批准。在SARS疫情期间，全球监管机构对疫苗研发进行了特殊调整，允许部分动物实验数据作为启动人类试验的基础，与后续动物实验同步进行。这些案例证明，通过科学监管创新和有效替代技术，可以在提高药物研发效率的同时，进一步减少对动物实验的依赖。尽管动物实验在生物医学研究中仍不可完全取代，但随着监管政策的改革和科技的进步，非动物方法将在药物和化学品开发中发挥更加重要的作用。通过国际协作和政策动员，3Rs原则的采纳正在推动实验伦理的提升与科学技术的进步。未来，替代技术的验证和法规灵活性的强化将进一步推动全球非动物方法的全面普及，并促进药物开发与审批标准的全球化协调。
