辛辛苦苦做实验取到样本，经过裂解、煮样、跑胶等WB步骤后，曝光后的条带却一片空白、模糊不清、背景脏乱……这些问题的出现，有可能在煮样这步就错了！
有人说这么简单的操作会出问题？不就是把样品放在金属浴煮上三五分钟的事情吗？并不是这样的！煮样是WB实验的关键步骤之一，操作不当可能直接导致蛋白降解、聚集或得率低下。今天我们就来聊聊煮样这件事。
煮样到底在煮什么？
煮样不仅仅就是把样品加热煮沸，其主要目的是让蛋白质变性并保持稳定。
细胞或组织中的蛋白质大多是折叠状态，空间结构复杂。煮样能促进SDS与蛋白质充分结合，让蛋白质完全变性、解聚成带负电荷棒状结构，利于按分子量进行电泳分离；可破坏维持蛋白质高级结构的非共价键，使其成线性结构，确保迁移率仅与分子量相关；能有效灭活蛋白酶，避免靶蛋白被降解；还能提高蛋白样品稳定性，减少聚集沉淀，去除气泡杂质。
总之，煮样确保了所有蛋白分子以均一、线性且带负电的状态进行后续电泳分离，其操作失败可能会影响WB结果。
煮样实操
加入蛋白loading buffer并充分混匀溶液，置于95-100℃煮样5-10 min，随后将样品离心置于冰上备用。
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注：煮样时间可根据蛋白浓度、分子大小、上样缓冲液比例等因素进行调整。如蛋白浓度高，可适当增加煮样时间，但最好不超过10 min，时间过长蛋白会出现凝固，导致无法进行后续实验。
煮样后的蛋白样品应尽快使用，如需要保存，短期保存可放置于4℃，长期保存应将样品置于-20℃，或分装后置于-80℃保存，避免反复冻融，通常可以保存一年以上，但建议3个月内使用。
彻底变性的蛋白在短期内重新电泳上样，无需再次煮沸。但当样品中出现颗粒物质或聚集物、样品长期储存变得浑浊或出现沉淀时，建议重新煮样。
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注意！煮样不要一刀切
WB实验中，并不是所有样本都要煮沸，如多次跨膜蛋白样本高温煮沸可能会导致膜蛋白聚集，聚集以后的蛋白可能无法正确进入凝胶迁移，堵在孔里；核蛋白样本不建议进行高温煮沸处理，直接离心取上清后上样即可；热敏感的蛋白煮沸处理会导致它们迅速降解。
那该怎么做呢？
膜蛋白：通过预实验确定膜蛋白的处理条件，比如设置温度梯度，在50-70℃加热10-15分钟，或者添加强效去污剂辅助溶解，如1% LDS、0.5% Triton X-114。
核蛋白：将样本直接与4℃预冷的loading buffer混合，利用低温环境避免蛋白结构被破坏。
热敏感蛋白：37℃放置10-30min，使用低温去污剂，如1% LDS
综上可知，WB电泳前制样的热变性不是一煮了事那样简单，要掌握不同蛋白的特性，避开煮样和操作中的误区，这样实验的成功率会大幅提升。
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