上一篇我们介绍APS的法规理解和基本概念，本文参考PDA TR22，深入讲解无菌工艺模拟验证的试验要素。从培养基选择、模拟频次到最差条件设定，结合国内外法规与实践案例，提供可落地执行的要点启示。
我们总结APS试验要素共15个方面，由于篇幅原因，本文将从前5大要素进行拆解。
要素1：培养基选择和制备
胰酪大豆胨液体培养基（TSB）是一种广谱性培养基，特别对无菌工艺环境中源自人体的细菌、芽孢和真菌有良好的促生长效果，是无菌工艺模拟试验常用的培养基。
但不是就可以认定APS中就一定要使用TSB，需要在风险评估中说明生产工艺（是否为厌氧工艺，氧气浓度低于 0.1%）的情况，以及分析历史产品工艺无菌检查中或环境中（反复）存在厌氧微生物污染的情况，先获得历史的信息，再通过评估输出培养基的种类。
使用含动物源性成分的培养基时，应确保其来源不含牛海绵状脑病/传染性海绵状脑病（BSE/TSE）风险。或者，可选用植物源性培养基（如植物蛋白胨培养基）作为替代方案。存在支原体或朊病毒传播风险的生产过程应始终使用植物源性生长培养基。
要素2：惰性气体
如果产品工艺中会充入惰性气体，需要在风险评估中评估工艺充惰性气体真实作用，作用不同，对应模拟的策略均是不同的。首先需要判断产品的工艺中是否要求残留氧含量低于0.1%，如果是，那这就属于厌氧环境的工艺，反之属于低氧环境，在低氧环境情况下，应以除菌过滤的空气替代惰性气体进行APS研究（需关注除菌过滤后的管道路径需保持一致，且任何气体替代操作均不得增加设备、工艺或人员风险）。
风险评估应明确描述无菌工艺的需氧或厌氧特性。风险评估还应包含其他来源的数据，这些数据可表明工艺或灌装容器中是否存在厌氧微生物，例如：FTM灭菌失败、厌氧环境监测结果（如适用）、惰性气体或其他原料（即保持粉末状态用于灌装的原料）的常规微生物检测失败。厌氧无菌工艺验证的实施应基于模拟无菌工艺过程中厌氧条件的相关结果和数据，并应说明严格厌氧无菌工艺验证的纳入和频率是否合理。
需特别注意：惰性气体系统的无菌性应通过过滤器验证、完整性测试以及过滤器下游连接管路的灭菌来实现，而非依靠APS系统来证明。
要素3：容器-密封件组合
当同一生产线生产相同容器密闭系统、不同容器规格的产品（一种或多种产品）时，无显著差异的无菌工艺过程可以考虑采用分组法与实际灌装速度范围共同进行风险评估，综合挑战无菌风险最高的生产条件，需要考虑灌装操作中复杂度最高的产品/选定的容器规格组合作为APS设计依据（即最差条件），所有规格尺寸均需要被评估到。如果风险评估无法判定这类括号法产生的为最差条件配置方案，则应在APS研究中增加额外的容器密封件组合方案。
初始无菌工艺模拟试验时可以通过评估考虑进行采用括号法的方式来验证，比如最大规格容器（暴露面积最大）和最小规格容器（操作最难）组合的形式进行灌装挑战（比如3+1或2+1批次）。此类情况下，后续的周期性半年度无菌工艺模拟试验应采取轮换方式测试最差条件及其他组合方案，而不是说后续的再验证只考虑最差条件，这不利于捕获与那些在初始评估中可能遗漏的尺寸相关的工艺变量。
如果产品配备的为有色容器，在实际模拟过程中建议更换为透明容器，且该替代容器需与原成品容器尺寸相同且材质一致，以满足APS要求。针对比如无菌凝胶等无法使用透明材料进行代替的，可采取在最终培养期结束后开启每个容器，将内容物转移至透明容器中，以便通过目视检查培养基是否存在潜在污染（如混浊）。
与各种容器密封特性相关的潜在风险
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容器密封特性 |
潜在风险示例 |
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开口较大的容器 |
微生物通过开口侵入的可能性更大 |
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开口较小的容器 |
在手动灌装ATMP的情况下，可能与操作员戴手套的手接触。或操作难度大 |
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更大的容器 |
灌装更大体积的产品可能需要更多的时间，增加了引入污染物的机会 |
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较小的容器 |
小容量产品灌装可能存在风险：若产品在瓶口附近积聚，容器开口靠近支撑轨道或导轨，或容器运行速度过快且/或稳定性较差导致倾倒频率增加，从而引发更高干预率 |
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生产过程中出现较高报废率的容器及密封件，以及运行难度较大或工艺复杂的容器及密封件 |
可能增加处理容器-密封件操作问题的干预频率 |
各种容器规格括号法的选择
要素4：灌装速度
灌装线速度应该设定在产品实际灌装的速度范围内，APS的灌装速度需要覆盖日常产品生产的灌装速度，当生产线上的生产灌装速度变化时，基于无菌风险的角度分析评价灌装速度对工艺过程及其他方面的影响程度，如果更高或更低的速度导致更大的干预或其他不利影响（如增加产品暴露于环境中），该速度可被视为最差条件，在选择工艺模拟参数时应予以考虑。如果不存在支持单一速度的明确理由，则多个速度应整合到一个APS中，或者应进行多个APS。
在给定生产线上使用多种速度的情况下，可以在APS中分段运行各设定速度，或者采用括号法将最慢和最快的速度。如果采用此法，那么在每种速度下灌装的单元数应该是APS所需的必要单元数。这里需要关注的是最差条件比如最快和最慢速度灌装的单元数不能过少导致无代表性。
要素5：灌装体积
灌装的体积不建议直接定一个装量，而不是基于风险评估决定（比如直接定义灌二分之一体积），需要基于风险评估决定灌装体积的多少。
灌装量应足以评估潜在的微生物污染，并确保倒置时与容器内所有无菌表面完全接触。所使用的体积应该提供足够的顶部空间以支持潜在的污染物生长，并且应该有足够的体积来目测生长。如果发现顶部空间不足以支持生长，或者发现容积不足以检测污染，则应调整产品容器的顶空或容积。
灌装的体积不宜过多，容器中应有足够的培养基以备能够检测到微生物的生长。要保证可能存在微生物能够获得足够的氧气。确保容器内留有足够的空气顶部空间容积以允许微生物生长。可通过对送入培养的每种规格容器进行特定的促进生长试验来支持此要求。
灌装的体积不宜过低，如果过低会导致已灌装的容器中没有有足够的培养基以保证在倒置和旋转时，培养基能够接触到容器和密封件表面，故培养基不足以检测微生物生长。首次APS时，建议增加装量体积下倒置和旋转时接触面积的研究来证明。优选灌装全容积的二分一或以上，这样倒置就能完全覆盖所有表面，当然这个是需要结合促进生长试验确定的装量。如果确认的装量小于全容积的二分一，需要有明确的方法规定倒置和旋转具体操作来保证与容器内所有无菌表面完全接触。
关于其他试验要素将在后续文章继续介绍，如有疑问欢迎留言。
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