关于凝胶剂中肌肽复合物在三维皮肤模型中透皮渗透的评估

原文作者：Valeria Dissette，Carlo Alberto Bignozzi，Giuseppe Valacchi，Alessandra Pecorelli，Stefano Manfredini，Silvia Vertuani

任何含有活性成分的化妆品的功效都是由两个因素决定的：分子的固有活性和该分子传递到作用部位的情况。活性成分的固有活性，或其表达功效的能力，决定了其功能概况，但不能保证含有该成分配方的最终功效。

为了使其功效表达，活性成分必须在适当的浓度和时间被送到作用地点。这一标准适用于所有类型的活性成分的所有功能，在皮肤美容科学中尤为重要。

由于皮肤是人体最具延展性的器官，这些概念因涉及大面积皮肤涂抹而特别相关。然而，为了使皮肤深层组织达到有效浓度，最上层的屏障——角质层(SC)也必须被克服。因为SC具有亲脂性，除了特殊的转运机制外，亲水分子是难以渗透的。因此，实现亲水性活性物质（如肽或类肽物质）的皮肤生物利用度，是有挑战性的。

本研究的重点是研究一种简单的二肽，L-肌肽，方法是把含有L-肌肽、镁离子复合体的凝胶制剂局部涂抹于人体皮肤。该复合体的作用是作为一种具有多功能的成分，包括抗氧化作用、缓冲酶和肌质网钙(Ca²⁺)调节，从而提高生物利用度。

肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)是一种分子量为226.23道尔顿的二肽，具有很强的亲水性，分配系数(log P)为-2.972±0.436。作为多种组织的组成部分，它具有多种生物学作用，包括pH缓冲和良好的抗氧化性能。肌肽是基于吲哚核(含组氨酸)而存在，特别是存在于骨骼肌。

降解酶，肌肽酶也存在于除了骨骼外的身体大多数组织中。这可以解释肌肽在骨骼肌中浓度最高的现象。

在人体骨骼肌中，肌肽的水平在5- 10 mM湿重或15- 40 mmol /kg干重范围之间。根据肌肉种类的不同，这些浓度在不同的动物物种中有所不同。

慢肌纤维中肌肽水平较低，具有长时间低氧潜水、频繁冲刺和爆发性飞行行为的动物具有较高的肌肽初始浓度。这一事实在厌氧运动中也得到了证实（也就是肌内肌肽浓度较高)。

另一方面，由于肌肽酶活性高，补充肌肽并不会增加其在血浆中的水平。被吸收的肌肽只有14%在尿液中被发现，而且由于β-ALA和L-组氨酸是肌肽的前体，研究指出了它们的补充可以合称肌肽。

此外，肌肽还具有其他生理功能，包括抗氧化应激。后者是由于不同的机制，如:金属离子螯合，清除活性氧(ROS)和过氧化氢自由基。被提出的ROS产生机制有几种，如电子输运系统中电子流量的增加，pH值的降低或呼吸作用的增强，都会导致血红蛋白由于组织中氧压过高而释放氧气。肌肽参与抗衰老过程，因为它似乎影响细胞寿命，影响衰老相关变化，使衰老细胞明显复苏。即使肌肽的作用机制尚不清楚，但体外和体内的研究证实，肌肽作为一种补充剂，或局部涂抹，对皮肤和肌肉有积极作用。大量的文献讨论了这种二肽的有趣特性，下面的几个例子支持了我们对这种分子抗老化应用的兴趣。

晚期糖基化终末产物(AGE)在皮肤中的积累与皮肤老化有关，抑制细胞外基质蛋白的糖基化有益于皮肤结构和外观。肌肽在体外皮肤外植体中具有抗糖基化活性。本研究中，面霜的抗糖基化效果明显优于肌肽水溶液(约为两倍)，说明了载体的重要性。在另一项研究中，研究人员评估了肌肽联合尿素和精氨酸对糖尿病(一种与加速衰老相关的疾病)患者足部皮肤严重干燥的疗效。一项持续了8个月的针对2型糖尿病患者的研究，这些患者有严重的足底干燥症，涂抹以润肤甘油为基础的霜(SEC)。与常用的甘油润肤乳相比，尿素、精氨酸和肌肽润肤乳能增加2型糖尿病患者的皮肤水分，改善皮肤干燥，在治疗后4周效果更佳。

在另一项研究中，调查了低分子肽，如肌肽在老年美容中的应用，在年轻和年老大鼠的皮肤细胞培养中，与其他小肽一起，证实可以刺激皮肤成纤维细胞增殖29-45%。在皮肤老化过程中，这种效应在较低浓度和水平的细胞培养液中被观察到。这些数据为在肌肽等小肽的基础上创造美容物质开辟了新途径。

暴露于紫外线(UVR)是皮肤老化和非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)发展的一个重要风险因素。虽然传统的防晒霜仍然是防止紫外线晒伤皮肤的支柱，但它们不能对紫外线照射引起的各种分子损伤提供完全的保护。嘧啶环丁烷二聚体(CPD)的形成以及DNA碱基的氧化损伤，包括8-oxo-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷(8OHdG)的形成是与光老化和肿瘤相关的关键DNA损伤之一。除了DNA损伤，被UVR诱导的自由基还可导致蛋白质羰基化(PC)，这是一种不可逆的蛋白质损伤的重要形式，使生物功能丧失活性。在最近的一项研究中一个新的外用产品，由传统的紫外线过滤、DNA修复酶和肌肽组成。通过对被辐射皮肤活体检测，与传统的基于紫外线过滤商业产品作比较，证实了新产品可明确改善研究中的氧化标志,如CPD、8OHdG和PC，从而降低皮肤老化和NMSC的风险。

有文献表明，与端粒相关的细胞衰老可能导致某些与年龄有关的疾病，包括癌症发病率增加、皱纹和皮肤弹性下降。已有研究表明，端粒长度在老年个体中可能不是一个明显的生存生物标志，但它可能是一个健康衰老的信息生物标志。以咪唑二肽肌肽为基础的天然化合物可能在临床上证明，在特定组织中（已知该组织中端粒缩短是氧化应激和疾病的一个独特标志），减缓端粒缩短的速度可以减缓人类衰老进程。关于老年个体的初步纵向研究，最近的一项研究表明，更长的端粒与改善个体生存相关，口服含非水解肌肽的营养物是维持关键端粒长度的有效治疗工具，可以从根本上被应用在延长预期寿命，增加生存和生物体的生理年龄。

最后，自2000年以来，多肽被用于外涂配方中来刺激胶原蛋白，促进伤口愈合，“类肉毒杆菌”抚平皱纹，以及抗氧化和抗菌。特别是肌肽和N-乙酰肌肽单独在水溶液中可减少人体皮肤的UVB红斑;这两种多肽都表现出抗氧化能力，在结合载体改善物质的皮肤穿透能力上具有更大意义。

鉴于这些不同的生理作用，特别是研究其在改善运动性能和/或减少肌肉疲劳方面的作用，提供了未来的许多研究方向。研究不同的营养方法在提高肌肉肌肽水平以优化生理活动和/或锻炼能力方面的作用也很重要。

Goebel等研究了肌肽联合渗透增强剂通过角质层的渗透,比如在亲水载体中的戊二烯醇作为渗透增强剂，实现低浓度二肽穿过角质层。虽然研究暂未深入，但考虑到这一点，我们的研究目的就是去评估肌肽复合物是否可以通过角质层影响生物利用度。我们选择了镁离子的络合剂；镁离子在角质层中浓度普遍较高，但在其他皮肤层中浓度均较低，这说明镁离子在屏障稳态、表皮分化等表皮功能中发挥作用。

 2.1 材料 

所有的被测样本都来自Pavia Farmaceutici s.r.l. (Copiano (PV), 意大利)。

本研究将三种不同的样本作为水凝胶配方，目的是评价络合剂镁作为肌肽渗透增强剂的作用。表1总结了测试的不同配方。

表1. 样本A：镁-肌肽复合物，有载体。样本B：肌肽，无络合剂，载体同样本A。样本C：镁盐，载体同样本A。

试样A的水凝胶含有肌肽、硫酸镁、乙氧基二甘醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油、菌核胶、甘油和水。所有用于制备样本的原料均符合化妆品规例1223/2009。

样品B除镁外，样品C除肌肽外，其他成分均相同。

样品A和C中镁盐的浓度为1.64%，样品A和B中的L-肌肽含量为1.50%。

将所有原料加入水溶液中，室温下搅拌，制得样品A;最后加入浓度为0.8%的胶凝剂菌核胶。溶液在搅拌器搅拌下，完成聚合物完全水化和凝胶化。

样品为透明无色凝胶，pH 5.5±1.0，密度0.90±0.10 g/mL，粘度(Brooksfield RV, Brooksfield- urai Spa, Assago (米兰)，意大利)，主轴6，rpm 10) 2500-4500 cps。

样品A被规定为一种化妆品。采用皮肤病学试验(局部闭塞试验)，在闭塞条件下对20名志愿者的健康皮肤进行无刺激性试验。样品A的微生物稳定性是通过挑战测试的，该测试确认了该配方中使用的防腐剂体系符合制造商Pavia Farmaceutici srl所提出的24个月的货架期。

本研究所用到的样品B、C均与样品A的原材料和制造步骤相同。

 2.2 EpiDermTM重建人体表皮（RHE）模型 

以重建人表皮(RHE)作为皮肤组织模型。EpiDermTM RHE模型由正常人角质形成细胞在气液界面生长的三维表皮组织组成。该模型在组织学上与人类表皮相似，呈现所有分化的细胞层，并具有阻渗屏障功能。EpiDermTM组织模型购自MatTek (MatTek体外生命科学实验室，位于斯洛伐克共和国的布拉迪斯拉发州。)

该模型被接收后，转移至SkinEthicTM维持培养基中，在5% CO₂湿化气氛，37°下保存，直至被水凝胶涂抹。

2.3 水凝胶涂抹于EpiDermTM RHE与样品收集

在三种水凝胶被应用前，除去培养基，加入新培养基。然后取三种不同的水凝胶各10 μL外涂在一组RHEs的表面，每24h单剂量涂抹，或者在另一组RHEs中每24h重复涂抹，共48h。对照组织单独暴露于载体培养基中。所有暴露的水凝胶和对照样品均用三套RHE对每组进行一式三份的检测。

在每个时间点，收集组织培养基试样，以1000倍 g、4 0℃，离心20分钟，去除不溶性杂质和组织碎片。透明上清液于零下20℃保存，待分析。用PBS洗涤后，在液氮中快速冷冻，取150μL PBS置于玻璃烧杯中，在冰上均匀化RHE组织。匀浆以5000倍 g离心5min，取上清，零下20℃保存，待分析。

2.4 肌肽的ELISA(酶联免疫吸附试验)技术

根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒(Elabscience Biotechnology Co.， Ltd.， Houston, TX, USA)测定不同时间点(24或48小时)RHE培养基和匀浆中的肌肽水平。所有的样品都进行了一式两份的检测。以肌肽为标准品做出标定曲线。用酶标仪在450 nm测量可视吸收率，结果用ng/mL表示。肌肽检测下限为8.438 ng/mL。

2.5  统计分析

平均数±标准差(SD)，采用学生t检验进行统计学意义评价。p值<0.05被认为是显著的。

2.6 组织处理与样本收集

在处理前，除去培养基，加入新培养基。三个不同的样本各取10μL (缩写A为：肌肽-镁盐复合物;B:肌肽，C:镁盐)。每24h单次给药，或每24h重复给药，共48h。对照组组织(CTRL)仅暴露于培养基中。由于对照组织中24 h与48 h无明显差异，因此我们将收集的样本合并作为对照组。所有混合物和对照样品均用三组RHEs进行一式三份的检测。

处理24 h和48 h后收集组织培养基试样，在1000倍g，4℃条件下离心20 min，去除不溶性杂质和组织碎片。用PBS洗涤后，在液氮中快速冷冻，取150 μL PBS置于玻璃烧杯中，在冰上均匀化RHE组织。匀浆以5000倍g离心5min，得到上清液，保存于零下20℃环境中，待分析。

为了评估含肌肽复合物的新凝胶配方(样本A)是否能够提高外部涂抹时二肽在人体皮肤上的渗透，研究人员测量了凝胶中释放出的肌肽的浓度和暴露了24h、48 h后RHE中的残留肌肽浓度。对不含活性成分(L -肌肽)(样本C)或只含有肌肽不含镁离子(样品B)的模拟水凝胶制剂的生物利用度进行了评价，并与样品A进行了比较。

3.1 凝胶中的肌肽水平

在外部涂抹后的24小时，也就是第一个时间点，与对照组相比，经肌肽复合物处理的RHE培养基(样本A)中检测到的L -肌肽水平更高(p = 0.028，表2和图1)。在未添加渗透增强剂的RHE培养基中(样本B)，肌肽水平有所升高，但与对照组相比，并无统计显著性 (图1)。值得注意的是，样品A和B之间的比较表明，经肌肽复合物处理的RHE培养基中的二肽水平显著高于样品B中的二肽水平(p = 0.043，表2和图1)。

在样品C (载体)培养基中，肌肽水平与对照组记录的肌肽浓度相当(表2和图1)。在第二个时间点(48 h后)，经过两次重复涂抹后，样品A培养基中的肌肽水平低于第一次检测的水平，但依然高于对照组(表2和图1)。B、C样品培养基中肌肽水平与第一时间检测的肌肽水平相似(表2和图1)。

图1。重建人表皮组织（RHE）中肌肽水平的研究。外用不同的水凝胶制剂24小时和48小时，肌肽在RHE培养基中释放的浓度。A:肌肽复合物;B:自由肌肽;C:镁盐、载体。数据以三个独立实验的均值±标准差(SD)表示。* p < 0.05是与未处理的对照组RHE相比，; §p< 0.05相比与24 h后的A;

表2。培养基中的肌肽水平与涂抹不同凝胶配方的RHE组织溶解产物的肌肽水平

3.2 RHE溶解物中的肌肽水平

为了测试不同配方的皮肤渗透能力，下一步中，我们测定了RHE组织中的肌肽水平。

24 h后，涂抹A试样的组织肌肽含量明显低于对照组(p= 0.019;表2和图2)。

涂抹B试样的组织中肌肽水平较对照组升高(表2和图2)，但无统计学差异(p = 0.708)。值得注意的是，样本B的肌肽水平明显高于样本A (p = 0.004;表2和图2)，表明了保留肌肽的趋势。涂抹C试样的组织中肌肽水平与对照组相似(表2和图2)。经过两次重复涂抹(48 h)，所有检测到的样本肌肽水平与对照组组织中检测到的肌肽水平相同(表1和图2)。

图2。RHE组织溶解物中肌肽水平。外涂不同的水凝胶，在24和48小时后RHE溶解物中肌肽的浓度水平测试。A:肌肽复合物;B:自由肌肽;C:镁盐、载体。数据以三个独立实验的均数±SD表示。*p<0.05对比未经样本处理的对照组；† p < 0.01对比24h后的样本A；§ p < 0.05对比24h后的样本A。

这一研究获得的结果支持凝胶配方中肌肽-镁复合物更有利于肌肽向内层皮肤渗透,数据显示，涂抹A比涂抹B对RHE培养基中肌肽浓度的提升有1.5倍促进作用。这与B试样的RHE组织表面肌肽残留量为A的1.9倍的观察结果相一致。正如C试样所预期的，肌肽水平与对照组组织记录的浓度相同。此外，最近的研究涉及了通过饮食传递肌肽的相关问题，在皮肤暴露于氧化环境时，如何促进肌肽在表皮的渗透的问题，以及使肌肽渗透到更深层皮肤的可能性。Schagen等人发现了使用乳剂方面的进步而不是解决方案。在我们的案例中，使用螯合金属大大提高了作为凝胶剂的简单配方的输送性能，取得了较好的效果。这些初步结果表明，结合金属螯合和性能更好的载体，仍有很大的可能改善肌肽的皮肤渗透。

很明显，解释在镁存在下更高的局部肌肽利用率需要进一步的研究。然而，我们可以提出假设，因为肌肽是一个多齿配体，它提供了几个潜在的结合位点:两个咪唑氮，一个羧基和氨基。在水溶液中，肌肽将羧基(Pk=2.6)脱元，形成带负电荷的阴离子。因此，与镁的配位是通过羧基功能与咪唑环N1氮的相互作用，形成1:1的阳离子肌肽镁络合物(图3)，近似103稳定不变。

带正电的肌肽-镁离子络合物，这可能是由于其小尺寸(86pm)，可能经历过强的电场，因此可以更好的与出现在膜蛋白和长链粘多糖带电氮原子结合，所以有利于氨基酸的跨膜运输。

我们的研究是在人体皮肤三维模型中进行的，代表了一个初步的结果。尽管如此，所获得的结果支持了络合可能是一种改善小的多齿多肽递送的策略的假设。事实上，我们选择肌肽是因为它引人注意的皮肤美容特性，即使通过简单的凝胶配方，肌肽镁络合物也能成功地释放肌肽，与游离肌肽相比，该络合物能在皮肤层下方提供比自由肌肽高60%的肌肽。目前我们正在进行进一步的研究，以探究肽以其他形式的络合在皮肤传递上的相关问题。