对酪氨酸酶抑制率的测定
对酪氨酸酶的抑制作用包括对单酚酶和二酚酶的抑制。以L-多巴和L-酪氨酸为底物，探究4-(1-苯乙基)-1,3-苯二酚对酪氨酸酶的抑制作用。
配制50mmol/L pH=6.8的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，并用其配制浓度分别为0.5mmol/L的L-多巴溶液、L-酪氨酸溶液和酪氨酸酶溶液，由于4-(1-苯乙基)-1,3-苯二酚不溶于水，用PBS配制38%的二甲基亚砜(DMSO)溶液后再配制成不同浓度的产品溶液。
实验方法:测试样的组成见表1。
将4种测试样于475nm处测定吸光度(A)，并以β-熊果苷作阳性对照。以测试样C为例:向试管中加入底物和样品溶液各1.5mL，在37℃水浴中充分作用10 min后加入1.5 mL酪氨酸酶溶液和2.5 mL pH=6.8的PBS，37℃水浴中再充分作用10 min后于475 nm处测定吸光度，每个实验测定3次取平均值，按式(1)计算酪氨酸酶抑制率I1:
I1=［1－(A3－A4)/(A1－A2)］×100%
式中，A1为测试样A的吸光度值；A2为测试样B的吸光度值；A3为测试样C的吸光度值；A4为测试样D的吸光度值。
由图4a可知，4-(1-苯乙基)-1,3-苯二酚对L-多巴和L-酪氨酸的半抑制浓度( IC50 )分别为8.598×10-5和0.0105g /L。
图4b中，以L-多巴为底物时，β-熊果苷对酪氨酸酶具有激活作用(-抑制率为负值)，而对L-酪氨酸具有抑制作用，其IC50 = 0.64 g /L。
对 Fe3+还原力的测定
测定美白产品对Fe3+的还原力。配制不同浓度的美白剂样品溶液和β-熊果苷溶液，按表2将液体加入试管中，以实验组为例，向试管中加入2.5mL 0.2 mol/L pH= 6.6的PBS，2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液，0.5 mL一定浓度的样品溶液，在50℃下充分作用20 min 后快速冷却，加入2.5 mL10%三氯乙酸溶液，取上述混合液2.5 mL，加入2.5 mL水，0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液后充分作用10 min，测定样液在700 nm处的吸光度，每个数据平行测定3次，取平均值，按式( 2)计算Fe3+还原力:
Fe3+还原力=(A1－A2)/A0×100%
式中，A0为空白组的吸光度值，用来消除溶剂影响；A1为实验组的吸光度值；A2为对照组的吸光度值。
4-(1-苯乙基)-1,3-苯二酚和β-熊果苷的质量浓度对Fe3+还原力的影响见图5。
由图5可知，4-(1-苯乙基)-1,3-苯二酚和β-熊果苷的半效应浓度(EC50)分别为0.033和0.12g/L，且二者对Fe3+的还原力均呈现随质量浓度的增加而增强的趋势。
对羟基自由基抑制率的测定
配制一定浓度美白剂和β-熊果苷的溶液，按照表3加入试管中，以实验组为例:向试管中加入2.0 mL 0.2 mol /L pH = 7.4的PBS，1.5 mL 1.0 mmol /L的邻菲罗啉溶液和1.0 mL 1.5 mmol /L的硫酸亚铁铵溶液，充分混匀后，加入1.0 mL一定浓度的样品溶液、1.5 mL水和1.0 mL 0.1%双氧水溶液，在37℃恒温水浴锅内保温60min后测定溶液于510nm处的吸光度，每个实验平行测定3次，取平均值，按式(3)计算羟基自由基的抑制率I2:
I2=［A样-( A损－A空)］/(A未损－A损)×100%
式中，A样为实验组的吸光度值；A损为损伤组的吸光度值；A空为空白组的吸光度值；A未损为未损伤组的吸光度值。
4-(1-苯乙基)-1,3-苯二酚和β-熊果苷的质量浓度对羟基自由基抑制率的影响如图6所示。由图6可知，4-( 1-苯乙基)-1,3-苯二酚和β-熊果苷的EC50分别为0.06和0.033g/L。4-( 1-苯乙基)-1,3-苯二酚随质量浓度的增加对羟基自由基的抑制率基本呈上升趋势。
然而β-熊果苷在达到一定质量浓度( 0.16 g /L)后，抑制率下降，因此在应用于配方时要注意其添加量。
对超氧自由基抑制率的测定
配制一定浓度美白剂和β-熊果苷的溶液，按照表4加入试管中，以实验组为例:向试管中加入3.5 mL 50mmol /L pH=8.2的Tris－HCl缓冲溶液， 2.9 mL水和0.3mL一定浓度的样品溶液，充分混匀在25℃水浴锅中保温20 min后立即加入在25℃中预热的 0.3 mL 3mmol/L的连苯三酚溶液，倒入比色皿，每隔30 s 测定320 nm处的吸光度，测试时间为5 min，并按式( 4) 计算超氧自由基的清除率 I3:
I3= ( k0 － k1 ) /k0 × 100% ( 4)
式中，k1 为实验组的斜率; k0 为空白组的斜率。
4-(1-苯乙基)-1,3-苯二酚和 β-熊果苷的质量浓度对超氧自由基抑制率的影响如图7所示。
由图7可知，4-(1-苯乙基)-1,3-苯二酚和β-熊果苷的EC50分别为0.32和0.37g /L，且二者对超氧自由基的抑制率不是完全的线性关系，当4-(1-苯乙基)-1,3-苯二酚达到一定质量浓度后抑制率反而会下降，而β-熊果苷在0.04 g /L后呈上升趋势，因此当应用于配方时要注意4-(1-苯乙基)-1,3-苯二酚的添加量。
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