在植物科学研究中，解析转录因子与DNA的互作机制，是构建基因表达调控网络的核心基础。传统的ChIP-seq技术依赖高质量特异性抗体，这一局限性使非模式植物的研究面临巨大挑战。DAP-seq（DNA Affinity Purification Sequencing，DNA亲和纯化测序）技术的出现，为研究模式和非模式植物基因表达调控机制，提供了高效解决方案。
今天小编介绍一下新技术DAP-seq及其在农学领域的应用案例。
DNA亲和纯化测序（DAP-seq）
将蛋白质体外表达技术与高通量测序技术相结合，高效筛选转录因子（TF）下游靶基因/结合位点的方法。
体外表达带标签（如His、Halo标签）的TF蛋白→与片段化基因组DNA（gDNA）孵育→利用标签抗体富集TF-DNA复合物→洗脱DNA进行建库测序→比对参考基因组分析TF结合的peaks→筛选TF的基因组富集区域DNA结合位点（motif），并鉴定TF潜在的靶基因。
图DAP-seq的实验流程
技术特点/优势：
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无需抗体/转基因：规避物种限制，尤其适合非模式植物。
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保留表观印记：可使用天然gDNA（含甲基化等修饰）。
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与ChIP-seq/Cut-tag对比：DAP-seq适用范围扩展至数百种缺乏遗传工具的植物物种。
DAP-seq更适用的情况（尤其适用于植物研究和部分小物种）
（1）抗体难以获取的样本：适用于研究非热门TF或非模式物种，此类样本通常难以获得商业化抗体。
（2）染色质提取困难的样本：对于染色质提取过程复杂、难度高的样本非常适用。
（3）蛋白表达丰度低的样本：可解决生物体内部分TF表达量低等问题。
经典案例1：植物转录因子DAP-seq助力解析葡萄的耐热性机制[1]
期刊名称：Nature Communications（15.7）
使用技术：GWAS+RNA-seq+DAP-seq
该文章主要研究普通耐热的遗传基础，首先利用GWAS和RNA-seq鉴定到葡萄耐热性的一个关键基因TTC4，然后利用DAP-seq找到了它的两个靶基因HSP18.1和APX3。同时，关联分析及相关验证表明TTC4内含子中的SNP变异调控葡萄耐热性。TTC4的发现为解析葡萄耐热性的分子机制提供了宝贵的见解，也为葡萄及其他作物的分子育种提供了潜在的应用价值。
图 通过DAP-seq进行全基因组TTC4结合位点鉴定
经典案例2：GmSop20——破解大豆油蛋白负相关的“平衡基因“[2]
期刊名称：Advanced Science（14.1）
使用技术：全基因组关联分析（GWAS）+全转录组关联分析（TWAS）+RNA-seq+DAP-seq
研究为了识别调控大豆种子油蛋白比的关键基因，首先通过整合全基因组与转录组关联分析，鉴定GmSop20为调控大豆油蛋白比的关键因子；然后利用DAP-seq揭示其直接结合并激活GmSWEETI0a启动子，协同人工选择位点增强糖向胚胎分配，促进油分积累，为定向设计大豆营养品质提供了新靶点。
图 GmSop2促进GmSWEET10a和GmSWEET10b的表达
经典案例3：PpMYC2和PpJAM2/3拮抗调控木质素合成以应对桃果实病害[3]
期刊名称：Plant Biotechnol Journal（10.5）
由实生链核盘菌（Monilinia fructicola）引起的褐腐病可导致桃果实腐烂率高达30%-80%。转录因子MYC2和茉莉酸相关MYC2-like（JAM）在非模式植物（尤其是采后果实）中的抗病调控机制仍不清楚。研究首先利用RNA-seq和DAP-seq鉴定出了受PpMYC2调控且与桃果实抗病性相关的候选靶基因（PpPAL1、PpC4H、Pp4CL1、PpCSE和PpCCoAOMT1），发现这两类转录因子通过调控这5个靶基因来共同促进木质素合成，形成对抗果实软腐病菌感染的保护性应答。
图 通过DAP-seq与RNA-seq的联合分析，鉴定出PpMYC2的潜在靶基因
基于DAP-seq筛选出的转录因子潜在靶基因，可通过以下多维度实验进行功能验证：
（1）电泳迁移测定（EMSA）：验证转录因子与预测结合位点的特异性互作。
（2）酵母单杂交(Y1H）：检测转录因子与DNA顺式作用元件的相互作用。
（3）体外Pull-Down实验：直接检测转录因子与靶基因DNA片段的结合。
（4）双荧光素酶报告系统（Dual-Luc）：通过荧光活性定量分析转录因子对靶基因启动子的调控效应。
（5）突变体表型分析（可选）：构建靶基因或转录因子突变体，观察表型变化以佐证调控关系。
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DAP-seq作为转录因子结合位点研究的关键技术，近年来在基础研究与应用领域均展现出显著的发文潜力。而凌恩生物通过优化DAP-seq实验方法，可提供从实验设计到数据分析的全流程服务，进一步助力科研加速。
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[1]Chen H, et al. A naturally occurring SNP modulates thermotolerance divergence among grapevines. Nat Commun. 2025 Jun 1;16(1):5084. doi: 10.1038/s41467-025-60209-2.
[2]Zheng H, et al. GmSop20 Functions as a Key Coordinator of the Oil-To-Protein Ratio in Soybean Seeds. Adv Sci (Weinh). 2025 Jul 18:e05181. doi: 10.1002/advs.202505181.
[3]Li Q, et al. PpMYC2 and PpJAM2/3 antagonistically regulate lignin synthesis to cope with the disease in peach fruit. Plant Biotechnol J. 2025 Sep;23(9):3524-3539. doi: 10.1111/pbi.70177.
