重磅推出！一种具有独特“TTNA”PAM 的LtCas12a有望成为未来分子诊断的强大工具！

舒桐科技

2023-04-19

导读：舒桐医疗团队自主研发出一种具有独特“TTNA” PAM的LtCas12a核酸酶，这一研究可以大幅拓宽Cas12a的靶向范围，并已经成功应用于人乳头瘤病毒HPV的快速诊断中。

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近日，舒桐医疗团队自主研发出一种具有独特“TTNA” PAM的LtCas12a核酸酶，这一研究可以大幅拓宽Cas12a的靶向范围，并已经成功应用于人乳头瘤病毒HPV的快速诊断中。该成果“A Cas12a ortholog with distinct TTNA PAM enables sensitive detection of HPV16/18”目前已成功发表于Cell旗下子刊Cell Reports Methods。原文链接

CRISPR-Cas核酸酶是目前最为广泛使用的基因编辑工具，在基础科研以及临床应用方面都有着广阔的前景。以LbCas12a和AsCas12a为代表的Cas12a家族也因其特性而受到深入研究，包括只需要单一的crRNA及其编辑性能的高保真度等。然而，CRISPR-Cas12a核酸酶的广泛应用受到“TTTV”PAM序列需求的阻碍。

LtCas12a的发现及其独特的PAM序列

通过我司自主开发的流程化新型CRISPR筛选鉴定平台，舒桐医疗团队从来自人类肠道样本中发现并深度鉴定了一种新型LtCas12a（与LbCas12a和AsCas12a序列同源性≦80%，体积大小为1,296 个氨基酸，分子量为152.7 kDa），它具有与经典“TTTV”不同的“TTNA”原间隔相邻基序（PAM），显著拓宽了Cas12a家族的靶向范围，同样表现出高编辑活性和特异性（图1E）。

LtCas12a核酸酶的CRISPR RNA（crRNA）由22个直接重复核苷酸序列（DR）和21-23个间隔区核苷酸序列(Spacer)组成 (图1A)。LtCas12a的PAM为 TTNA (N 代表 A, T, C, G)（图1C），与传统的LbCas12a、AsCas12a和FnCas12a的TTTV PAM不同，这使得LtCas12a可以靶向其他CRISPR-Cas12a所不能编辑的位点！以HPV为例，LtCas12a可以靶向140个和136个TTTV无法实现的靶向位点（图2 ab），这对于宫颈癌的基因治疗或病原体诊断具有重要意义！

图 1

图 2

基于CRISPR-Cas12a（LtCas12a）的

HPV快速检测系统

依托于CRISPR-Cas12a系统的高特异性识别目标序列和反式切割能力，CRISPR-Cas12a诊断技术可以快速诊断任何已知的核酸序列。与传统的分子诊断技术相比，CRISPR/Cas诊断技术具有高灵敏、高特异、快速和低成本等明显优势，可广泛应用于POCT、临床感染检测、肿瘤筛查、伴随诊断、食品安全等多个领域。

以人乳头瘤病毒（HPV）为例，本研究基于由 CRISPR-Cas12a（LtCas12a）核酸检测联合RPA等温扩增技术，首次设计单管反应即可对临床样本中的少量 DNA 进行快速、简便地即时检测，可用于HPV的早期筛查和诊断。先利用RPA系统扩增靶标序列后，CRISPR-Cas12a（LtCas12a）启动反式切割ssDNA荧光报告分子，可直接检测荧光，或者引入FAM-Biotin报告分子，以利用试纸条侧向流分析直接观察。整个过程可以在45分钟内检测HPV并准确区分两种高危亚型：HPV16和HPV18（图3）。

图 3 快速分子诊断原理图

准确性与传统RT-PCR检测相当

从检测的灵敏度和特异性来看，HPV16/18 L1 DNA在胶体金试纸的检出限约为30拷贝（图4a），表现出较高的灵敏度。同时基于LtCas12a的LFA试纸条检测在区分HPV16、18分型和其余13种高危HPV基因型，表现出很强的特异性和准确性（图4b）。接下来，我们收集来自36名患者的宫颈刷片（已完成qPCR验证的HPV样本），基于LtCas12a的检测在HPV临床样本中的表现来看，HPV16检测的敏感性为90%，特异性为96.2%，对HPV18检测的敏感性为90%，特异性为92.3%（图5C）。这一结果表明，未来检测者能够实现在家庭环境中完成HPV核酸即时检测，这一过程无需特殊设备或专业医护人员，避免了繁琐的检查和长时间结果等待。在医疗资源有限的地区加快HPV筛查的覆盖，这对宫颈癌的预防和治疗至关重要。因此，基于LtCas12a技术的开发为实现病原体或肿瘤基因的即时检验（POCT）提供了一个强有力的支撑平台。

图4

图5

舒桐医疗凭借多年的重组蛋白和重组分子酶的开发经验，现可提供GMP级别的LtCas12a酶产品，助力基于CRISPR/Cas技术的分子诊断研究和产品开发。

产品信息

产品效果图

舒桐医疗LtCas12a的反式切割活性

应用案例

基于CRISPR/Cas12a（LtCas12a)系统检测样本中HPV16/18的L1基因

实验结果表明，与传统”金标准”qPCR方法相比，基于LtCas12a检测平台的检测限（LOD）（上图a）为30个拷贝，与qPCR方法的敏感性相当（上图b、c）。

关于舒桐

珠海舒桐医疗科技有限公司深耕基因编辑技术10余年，是一家以基因编辑为核心技术的生物医药服务企业，可承接脱靶检测、细胞株定制、病毒包装等CRO及CDMO业务。目前，舒桐科技拥有3000㎡的GMP研发实验室及生产车间；拥有博士后科研工作站及澳门理工大学教学科研实习基地。研发团队熟练掌握各类基因编辑技术，包括基因编辑、碱基编辑及先导编辑等，成功完成如基因敲除、点突变、大片段插入、过表达等细胞系构建项目；开发了多种具有自主知识产权的脱靶检测技术，建立了高通量的sgRNA筛选平台；建立了工厂化新型CRISPR挖掘体系，已开发出多种切割效率高且低脱靶的新型CRISPR。公司目前已申请基因编辑、脱靶检测、新型CRISPR及药物递送等专利70+项，授权50+项。同时，公司具备先进的CGT原料规模化生产能力，产品质量达到领先水平，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐科技坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。