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基因编辑技术之prime editing

舒桐科技

2023-05-15

导读：舒桐科技长期致力于基因编辑领域，研发团队潜心研发了一个高效的Suntag-PE系统，观察到在nCas9的N端带有1×Gcn4的Suntag-PEs是最有效的构型。

传统的基因组编辑方法通常需要使用限制性内切酶或转录翻译活化因子等工具，或是引入外源的DNA序列，才能实现对基因组的编辑。这些方法可能会导致难以预测的不良影响，且在某些细胞类型中的应用效果不佳。为了解决这些问题，来自哈佛大学的刘如谦团队在Nature上发表了一篇名为Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA的文章，提出了一种名为“prime editing”的新型基因组编辑技术。

PE基因编辑技术是将单链切割形式的nickase Cas9（nCas9）与逆转录酶（reverse transcriptase，RT)进行融合，且在sgRNA序列上添加一段特殊的逆转录RNA模板（prime editing guide RNA, pegRNA），从而将新的遗传信息直接写入特定位置（Fig.1b）。pegRNA具有三段序列：sgRNA，包含了一个由20个核苷酸组成“导向序列”，该序列与目标DNA序列互补；引物结合位点（primer binding site, PBS），与断裂的靶DNA链3’末端互补以起始逆转录过程；逆转录模板（RT模板），其上携带有目标点突变或插入缺失突变。其中PBS和RT逆转录模板是位于sgRNA的3’端延伸序列。在pegRNA的引导下，Cas9切断含PAM的目标序列，目标序列与PBS结合，开始逆转录反应。目标序列的切口处形成一个5’flap包含未编辑的DNA序列，另一个3’flap包含从pegRNA复制的编辑序列（Fig.1c）。

对于PE技术的可行性，作者通过体外细胞实验进行验证。首先，使用含有切口的dsDNA、dCas9、逆转录酶MMLV RT来测试这些候选pegRNA与逆转录的兼容性，发现底物可以发生延伸反应，并且随着逆转录模板长度的不同，产生与模板链长度相对应的延伸产物。这表明dCas9和MMLV RT能够在pegRNA的引导下结合到DNA切口处，并由后者引发带切口的DNA发生逆转录反应。当用传统的sgRNA取代pegRNA时，没有观察到DNA聚合产物（Fig.1 d）。接下来，作者用nCas9（H840A）测试了不含缺口的dsDNA，在适当的pegRNA作向导链和逆转录模板链的情况下，也可实现dsDNA切口和逆转录（Fig.1e）。为了评估由pegRNA逆转录产生的3’flap在体外的真核细胞DNA修复结果，作者用质粒进行PE编辑，并且将反应产物转化到酵母细胞中，结果表明DNA修复机制可解析PE产生的3’flap结构，实现精确的颠换、插入和缺失编辑（Fig.1e）。

Fig 1. Overview of prime editing and feasibility studies in vitro and in yeast cells

PE1: 将M-MLV RT与Cas9（H840A）的C端融合，构建出第一代PE编辑工具PE1。

PE2：对M-MLV RT进行优化，引入提高其热稳定性和结合引物-模板复合物亲和力等突变，还摸索了包括PBS和RT模板长度与PE2编辑效率的关系（Fig.2a-b）。

PE3/PE3b：在PE2基础上增加可引导切断非编辑链的sgRNA，PE3对HEK293T细胞中四种靶基因的编辑效率提高了1.5至4.2倍；PE3b是在PE3基础上对sgRNA序列进行优化（Fig.3a-c）。

Fig 2. Prime editing of genomic DNA in human cells by PE1 and PE2

Fig 3. PE3 and PE3b systems nick the non-edited strand to increase prime editing efficiency

文章后面还检测了PE3在不同条件下的基因编辑效率（Fig.4），以及探究了PE3对人类遗传疾病相关突变的编辑能力。在 HEK293T细胞中，对不同致病基因的编辑效率分别如下：镰状细胞贫血症的HBB基因 58%；Tay-Sachs病的HEXA基因 33%；朊蛋白病的PRNP基因 53%（Fig.5a-c）。小鼠的原代皮质神经元中，观察到DNMT1的平均编辑效率为7.1%，在分离的皮质神经元核中的Indel为0.58%，在同一慢病毒系统中，Cas9导致了31%的Indel。同源重组的编辑方式与PE3相比，Indel的水平要高得多。（Fig.5d-f）。

Fig 4. Targeted insertions, deletions, and all 12 types of point mutations with PE3 at seven endogenous genomic loci in HEK293T cells

Fig 5. Prime editing of pathogenic mutations, prime editing in primary mouse cortical neurons, and comparison of prime editing and HDR in four human cell lines

珠海舒桐医疗科技有限公司长期致力于基因编辑领域，研发团队潜心研发，开发了一个高效的Suntag-PE系统，为优质编辑提供了高效的模块拆分策略，并进一步促进了其在临床上的转变。现该技术主要用于细胞点突变项目，如果您对此感兴趣，欢迎咨询！

关于舒桐

珠海舒桐医疗科技有限公司深耕基因编辑技术10余年，是一家以基因编辑为核心技术的生物医药服务企业，可承接脱靶检测、细胞株定制、病毒包装等CRO及CDMO业务。目前，舒桐科技拥有3000㎡的GMP研发实验室及生产车间；拥有博士后科研工作站及澳门理工大学教学科研实习基地。研发团队熟练掌握各类基因编辑技术，包括基因编辑、碱基编辑及先导编辑等，成功完成如基因敲除、点突变、大片段插入、过表达等细胞系构建项目；开发了多种具有自主知识产权的脱靶检测技术，建立了高通量的sgRNA筛选平台；建立了工厂化新型CRISPR挖掘体系，已开发出多种切割效率高且低脱靶的新型CRISPR。公司目前已申请基因编辑、脱靶检测、新型CRISPR及药物递送等专利70+项，授权50+项。同时，公司具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐科技坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。

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参考文献：

[1]Anzalone A V, Randolph P B, Davis J R, et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA[J]. Nature, 2019, 576(7785): 149-157.

[2] Hu Z, Tian R, Liu J, et al. SunTag-PE: a modular prime editing system enables versatile and efficient genome editing[J]. bioRxiv, 2023: 2023.01. 13.524016.

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珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药服务企业，可承接脱靶检测、细胞株定制、病毒包装等CRO及CDMO业务。同时公司具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。

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