Nature子刊综述｜从DNA到RNA编辑评估和推进CRISPR-Cas工具的安全性（上篇）

舒桐科技

2023-07-20

导读：本综述回顾了CRISPR-Cas9/Cas12/Cas13核酸酶、DNA碱基编辑酶、Prime编辑酶和RNA碱基编辑酶的发展，重点关注了它们在编辑精确性和安全性方面的评估与改进，不断突破编辑特异性和效

SUMMER 2023 /

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引言

CRISPR-Cas基因编辑技术在过去十年中对分子生物学领域带来了革命性的影响，并在人类遗传疾病治疗方面展示出巨大的潜力。这篇综述回顾了CRISPR-Cas9/Cas12/Cas13核酸酶、DNA碱基编辑酶、Prime编辑酶和RNA碱基编辑酶的发展，重点关注了它们在编辑精确性和安全性方面的评估与改进，不断突破编辑特异性和效率的限制。此外，综述还总结了各种基于新一代测序（NGS）的方法，用于探索遗传变化并评估基因编辑过程中的安全性问题。最后，强调了基因治疗领域未来的改进和在基础研究、治疗和临床中的潜在应用。

基因编辑的“安全杀手”

尽管CRISPR-Cas核酸酶的目标DNA特异性由sgRNA决定，但Cas蛋白可以通过与非靶DNA序列进行非典型碱基配对相互作用，导致它们结合并进行切割，即发生了脱靶效应，

另一方面，CRISPR-Cas9诱导的DSB可导致较大的基因组重排，包括大片段染色体缺失、倒位或易位，甚至更可怕的事件，如染色体畸变、非整倍体、染色体丢失和p53激活，这些事件可富集致癌细胞。虽然染色体重排可能是罕见事件，但令人担忧的是，即使是携带这些有害事件的极少量CRISPR-Cas9编辑细胞也可能在体内克隆扩增并导致疾病。

目前，用于全基因组鉴定和表征潜在CRISPR-Cas核酸酶非靶位点的方法可分为三类：

1、使用基于序列同源性的算法进行CRISPR-Cas非靶位点预测，例如Cas-OFFinder等。

2、体外剪切位点鉴定：使用基因组DNA模板体外鉴定裂解位点，以确定CRISPR-Cas的非靶位点。

3、细胞内捕获：通过在细胞内捕获非靶编辑事件的方法来鉴定CRISPR-Cas的非靶位点。

CRISPR-Cas 系统的评估及优化

（一）Cas-OFFinder是一种广泛使用的用于Cas9诱导非靶位点预测的计算机软件。舒桐科技可以提供Cas-OFFinder预测服务（基因编辑工具分享（一） | sgRNA脱靶预测线上工具Cas-Offinder）。已开发了几种基于网络的预测算法，用于对基因组中特定引导RNA的潜在非靶位点进行排名。尽管基于序列相似性的计算预测算法具有强大和有用的特点，但可能需要更多的训练数据和更丰富的生物物理框架才能完全预测非靶位点的潜力。目前，计算生物学预测需要通过实验方法进一步补充，以有效地识别真正的非靶位点。

（二）一类是基于实验室内体外脱靶检测方法，利用纯化的基因组DNA和Cas9或Cas12 gRNA核酸酶核糖核蛋白复合物进行非靶位点鉴定。其中，常用的方法包括Digenome-seq、DIG-seq、CIRCLE-seq、CHANGE-seq和SITE-seq，各方法的检测原理如下图所示。其中Digenome-seq和DIG-seq需要很高的测序深度，有大量非Cas酶切割产生的随机背景信号，缺乏检测包含低频位点在内的全部脱靶位点的灵敏度，不适合用于大批量筛选sgRNA。CIRCLE-seq由于环化效率较低，导致建库需要的基因组DNA起始入量较大，限制了该检测方法在难以培养的原代细胞和珍贵临床标本检测中的应用；CHANGE-seq存在不可忽视的假阳性问题，它主要是由游离的DSB断端导致的，需要寻求降低背景DSB断端从而降低假阳性的方法。

综述Fig.2

舒桐科技推出的AID-seq相对于以往的体内外脱靶检测方法（IF=17分！重磅发布：珠海舒桐团队开发超灵敏特异的脱靶检测方法AID-seq发表于Cell旗舰子刊Med），具有以下几个优点。首先，其应用范围更广，不受不同物种（人、动物、植物、细菌、真菌等）、不同细胞类型（细胞系、原代细胞、非分裂细胞等）和转染效率的影响。其次，AID-seq不需要提取完整的高分子量DNA，DNA起始入量也很小（2ug），因此对DNA制备难度大的实验更加友好。第三，AID-seq可以检测更多的低频和真正的脱靶，这对基因治疗至关重要。

（三）一类是基于实验室体内方法的脱靶检测，主要分为4类：

1. 通过修复产物间接标记非靶位点断裂：GUIDE-seq、HTGTS、IDLV capture、PolyA-seq、PEAC-seq

2. 通过DNA修复蛋白间接标记非靶位点断裂：DISCOVER-seq

3. 通过原位直接标记未修复的断裂端：BLESS、BLISS

4. 通过捕获R-loop介导的单链DNA间接标记非靶位点：CROss-seq

各方法的检测原理下图所示。GUIDE-seq是最常用的方法之一，通过线性双链寡核苷酸（dsODNs）插入到CRISPR-Cas编辑产生的DSB位点。在dsODNs插入后，选择性扩增并测序特定序列及其邻近的基因组序列实现非靶位点的检测。舒桐科技可提供GUIDE-seq体内脱靶检测的服务，详情可查看舒桐科技官网官网。

HTGTS利用Cas核酸酶引发的目标DSB（诱饵）和非靶DSB（猎物）之间的染色体易位来捕获全基因组范围的非靶位点。LAM-HTGTS通过降低成本来提高其灵敏度，而PEM-seq、CAST-seq和UDiTaS等类似技术进一步发展，可系统和定量地计算不同编辑结果（如indels、非靶位点和染色体结构变异）的频率，尤其适用于临床前和临床评估。舒桐科技可提供检测染色体异位和重排的PEM-seq检测技术，包括检测出大片段染色体缺失、倒位或易位等等，详情可点击：基因脱靶分析技术｜PEM-seq全面解析染色体重排易位。

综述Fig.2

目前，还没有针对所有需要评估CRISPR-Cas核酸酶脱靶活性的情况进行优化的单一方法。因此，最好的策略可能是通过使用多个方法来评估和验证脱靶效应，舒桐科技可全方位帮助客户洞悉基因编辑药物的全貌，可为客户提供个性化的脱靶检测方案，根据药物研发需求和目标基因，确保检测的准确性和有效性。

如何有效减少CRISPR-Cas系统脱靶效应和染色体重排？

为减少脱靶效应和基因组重排，可以通过优化CRISPR-Cas系统的不同组分来实现。选择具有高编辑效率和低脱靶活性的sgRNA是一种增加安全性的首选策略，特别是在临床应用中，舒桐科技提供有各种sgRNA设计和筛选的工具，详情可点击知识分享 | CRISPR/Cas9之sgRNA的设计。此外，已经开发了几种方法来减少CRISPR核酸酶引发的脱靶效应和基因组重排，同时保持强大的靶向活性，包括sgRNA的修饰、Cas9蛋白的优化、Cas9系统的修改和递送改进。舒桐科技建立了工厂化新型CRISPR挖掘体系，已开发出具有自主知识产权的多种切割效率高且低脱靶的新型CRISPR-Cas工具酶，详情可点击喜讯 | 舒桐科技自研高保真CRISPR-FrCas9获国际专利授权！。

从形式上来看，CRISPR-Cas系统可以通过质粒DNA或编码其表达的mRNA递送到细胞中，也可以直接以蛋白质或核糖核蛋白(RNPs)的形式递送。研究表明，RNPs可以减少脱靶效应，因为它们在转染后立即作用于靶向DNA，并在细胞中被蛋白酶和核酸酶迅速降解。例如，通过外泌体介导的Cas9 RNPs传递已被用于治疗肝脏疾病的组织特异性基因疗法。此外，考虑到编辑位点上可能存在大量的质粒DNA或病毒DNA整合，RNPs可能是CRISPR-Cas工具更安全的传递方法。

内源性LINE-1逆转录转座子在RNPs介导的CRISPR-Cas编辑过程中仍可能存在潜在风险，Base Editing或Prime Editing减少了双链断裂的发生，可以作为更安全的替代方法。

上半部分内容就分享结束啦！各位小伙伴们，敬请关注下篇推文：从DNA到RNA编辑评估和推进CRISPR-Cas工具的安全性（下篇）！

关于舒桐

珠海舒桐医疗科技有限公司深耕基因编辑技术10余年，是一家以基因编辑为核心技术的生物医药服务企业，可承接脱靶检测、细胞株定制、病毒包装等CRO及CDMO业务。目前，舒桐科技拥有3000㎡的GMP研发实验室及生产车间；拥有博士后科研工作站及澳门理工大学教学科研实习基地。研发团队熟练掌握各类基因编辑技术，包括基因编辑、碱基编辑及先导编辑等，成功完成如基因敲除、点突变、大片段插入、过表达等细胞系构建项目；开发了多种具有自主知识产权的脱靶检测技术，建立了高通量的sgRNA筛选平台；建立了工厂化新型CRISPR挖掘体系，已开发出多种切割效率高且低脱靶的新型CRISPR。公司目前已申请基因编辑、脱靶检测、新型CRISPR及药物递送等专利70+项，授权50+项。同时，公司具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐科技坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。