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DNA聚合酶相信科研工作者都不陌生，现已广泛应用于生物科研领域中的DNA体外扩增。自Taq DNA聚合酶开发以后，科学家对DNA聚合酶的探寻和研发呈井喷式爆发，由于PCR的特性，科学家把目光投向高热极端环境的古生菌，以探寻出兼具耐热性和高保真的DNA聚合酶。如今，B家族高保真聚合酶在体外扩增发展中脱颖而出，它之所以成为众多科研工作者的选择，主要是有以下特性：
（1） 具备更高的耐热性
相对于Taq DNA聚合酶，B家族DNA聚合酶的来源菌株生活在温度更高的极端环境中。如Pfu、Deep Vent等来源菌株均可以在高达100℃的水中生活。更高的耐热性意味着在PCR反应中，酶的活性更稳定，变性温度下半衰期更长。
（2）3’→5’核酸外切酶活性
B家族DNA聚合酶在应用上的最大特点是3’→5’核酸外切酶活性。在DNA合成过程中，如果出现错误的碱基被催化掺入DNA链，则酶自身的构象发生改变，激发核酸外切酶活性，此时5’→3’的聚合进程暂停，直到错误碱基被切除。这一机制保证了较高的DNA体内外合成的保真度。
（3）PCR产物为平末端
由于B家族DNA聚合酶具有3’→5’核酸外切酶活性，虽然它和Taq DNA聚合酶一样存在末端转移酶活性（TdT activity），但不会对扩增产物3’端增加一个A碱基。因此，使用具有3’→5’核酸外切酶活性的B家族DNA聚合酶扩增产物为平末端（Blunt）。
KOD DNA聚合酶作为B家族的一员，也广受科研工作者的青睐。KOD DNA聚合酶是1997年日本教授Masahiro Takagi从日本鹿儿岛县小宝（Kodakara）岛的含硫气孔中分离出来的超嗜热古生菌（Thermococcus kodakaraensis）KOD1分离出来的、具有高扩增能力和高保真性的DNA聚合酶。蛋白质的结构决定功能，以下分享学者对KOD DNA聚合酶晶体结构的解析：
KOD DNA聚合酶由不同的结构域和亚结构域组成。即N末端结构域（1-130,327-368）；核酸外切酶结构域（131-326）；聚合酶结构域，包括Palm和Fingers亚结构域（369-449，500-587；450-499）；Thumb结构域，包括Thumb-1和Thumb-2亚结构域（588-774）。聚合酶活性位点包括三个保守的羧基（Asp404、Asp540和Asp542），位于Palm亚结构域的反向平行β-折叠中。核酸外切酶的活性位点含有两个保守的羧基（Asp141和Glu143），位于外切酶结构域的反向平行β-折叠中。
图1(a) KOD DNA聚合酶整体结构
古生菌DNA聚合酶（KOD、Tgo和9°N-7 DNA聚合酶）结构比较如图1(b)所示。三者的蛋白质结构是相同的，但结构域和亚结构域的空间方位有一定区别。与其他古生菌DNA聚合酶相比，KOD DNA聚合酶的Thumb结构域发生大幅移动，形成一个更为“开放”的构象，同时，与Thumb域根部相邻的Palm域部分也略有移位。
图1(b) 三种古生菌DNA聚合酶Thumb结构域构象比较
温度因子是衡量原子位置不确定性的一种方法。表1展示了KOD DNA聚合酶晶体结构中结构域和亚结构域的平均温度因子。由于Thumb-2亚结构域的方位高度无序，许多残基的结构尚未确定。
表1 各域的平均温度因子
聚合酶结构域
聚合酶结构域由Palm和Fingers亚结构域组成，呈现“L”字形。此前聚合机理的研究主要集中在A家族DNA聚合酶上，噬菌体T7 DNA复制复合体的研究为金属辅助的磷酰基转移机制提供了结构基础。该复合物结构显示，两个金属离子与从Palm结构域反向平行的β-折叠延伸而来的保守羧基（Asp475和Asp654，对应KOD DNA聚合酶中的Asp404和Asp542）相结合。金属离子对掺入的dNTPs的磷酸基团起到了固定作用。
在B家族DNA聚合酶中，Fingers亚结构域主要由两个长螺旋组成，且没有A家族DNA聚合酶结构中的“关节”。因此，在古生菌DNA聚合酶中，聚合酶结构域将dNTPs运送到活性部位的运动似乎和A家族的不同。KOD的保守残基Arg460、Lys464、Lys487和Asn491，以及位于聚合酶活性部位一侧Fingers亚区的顶端的Lys468、Arg476、Lys477和Arg484——经预测，这些碱性残基“阵列”会捕获掺入的dNTPs，随后dNTPs随着聚合酶结构的移动而被递送到聚合酶活性中心。
在Palm和Fingers亚域之间的连接位置上存在两个二硫键（图2(a)；Cys428-Cys442 and Cys506-Cys509）。这两个二硫键也出现在Tgo、Tok和9°N-7 DNA聚合酶中。普遍认为，在极端高温下，DNA聚合酶需要通过二硫键来维持Fingers和Palm亚域。
图2(a) 聚合酶结构域
古生菌DNA聚合酶具有甘氨酸残基和芳香族残基邻接的序列特征。这些序列位于Palm亚域与Fingers和Thumb-1亚域连接的铰链处。因为邻接的甘氨酸残基的存在，这些芳香族残基可以提供良好的化学环境。这可能有助于聚合过程中聚合酶结构域的构象变化。
3’→5’核酸外切酶结构域
DNA的合成有赖于在引物3’端启动延伸时的聚合酶速率和3’端核酸外切酶活性。错误的核苷酸掺入会破坏引物3’端的双链DNA结构。这会降低引物3’-OH对掺入的dNTP的α-磷酸基团的亲核攻击速率，并激活核酸外切酶校对切除不正确的核苷酸。由于外切酶活性位点与聚合酶活性位点是分开的，在KOD DNA聚合酶中，两者相距约40Å，因此切除时需要将3’端转移到外切酶活性位点，并伴随双链DNA的重绕。
图2(b) KOD DNA聚合酶和RB69 DNA聚合酶（半透明色）的核酸外切酶结构域比较
KOD DNA聚合酶的残基242-249形成一个延伸的β发夹结构，直接从蛋白质表面突出到DNA中，该结构与RB69 DNA聚合酶相似，其作用是稳定部分变性和解链的结构。其中的Arg247残基，延伸至分叉点（Forked point），即模板结合和编辑裂隙（分别为T-cleft和E-cleft）的连接处。Arg247能够分离模板链和引物链。Phe152与活性位点分开，因此它需要通过环运动抵达E-cleft处与引物发生芳香相互作用。两者通过与模板-引物3’端倒数第二个碱基相互作用来封闭模板链。此外，Arg243从β-发夹结构延伸到T-cleft。Arg243与模板链相互作用，将其固定在T-cleft处。
图3 KOD DNA聚合酶分子表面静电势图
除Arg243和Arg247外，5个精氨酸残基聚集在KOD DNA聚合酶的分叉点，包括Arg265、Arg266、Arg346、Arg381和Arg501，提供了一个基础环境。它们可以与DNA链的磷酸基团相互作用，并稳定分叉点处DNA的解链结构。在来自超嗜热古生菌的已知B家族DNA聚合酶中，分叉点处一些精氨酸残基是保守的。
KOD DNA聚合酶的优势
KOD DNA聚合酶在耐热性、扩增能力、校正能力都颇具优势。研究显示，它可以在95℃下维持活性12小时；其保真性比Pfu DNA Polymerase更高，约为Taq酶的50倍，优化后的PCR反应缓冲液使得其扩增速度达到Taq酶的2倍，Pfu酶的6倍，达到100~138bp/秒，短时间内可以获得高产量的扩增产物，特别适合于高保真地扩增6kb以内的PCR产物。
图4 DNA聚合酶保真度比对
KOD DNA聚合酶的应用
（1）高保真DNA片段的快速扩增
（2）富含GC和复杂模板扩增
（3）平末端克隆
（4）定点突变
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参考文献
[1]Hashimoto H, Nishioka M, Fujiwara S, et al. Crystal structure of DNA polymerase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1. J Mol Biol. 2001 Feb 23;306(3):469-77.
[2]Kitabayashi M, Nishiya Y, Esaka M, et al. Gene cloning and polymerase chain reaction with proliferating cell nuclear antigen from Thermococcus kodakaraensis KOD1. Biosci Biotechnol Biochem. 2002 Oct;66(10):2194-200.