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2024年7月，Nature Chemical Biology杂志发表题为Simultaneous multi-site editing of individual genomes using retron arrays的研究成果，介绍了一种名为“multitron”的技术，该技术能够同时对单个基因组的多个位点进行精确编辑，为基因组研究和生物技术应用带来了全新的可能性。
在过去的研究中，我们对基因组的理解受到技术规模的限制。虽然基于CRISPR gRNAs的基因组文库已经取得了很大的进展，但这些现有方法通常是在多个基因组上进行多路复用，而无法深入研究单个基因组内多个位点之间的编辑作用。
为了解决这一问题，科学家们开发了multitron技术。该技术基于经过大量修饰的retron，retron是细菌中的一种三联体系统，具有提供噬菌体防御的功能。通过对retron的ncRNA进行改造，使其在逆转录后能从单个转录本同时产生多个编辑供体。
在实验中，研究人员首先测试了在retron的msd中编码多个供体进行多重重组的能力。他们构建了两种版本的multitron，均能成功编辑rpoB和gyrA两个位点，且编辑率与单重编辑相当。进一步研究发现，第一个供体编辑的位点往往具有更高的编辑率，这可能与RT的持续性或供体逆转录后的位置效应有关。通过与合成寡核苷酸的对比实验，证实了RT持续性对编辑效率的影响。
为了克服供体位置的影响，研究人员构建了ncRNA阵列式multitron和msd阵列式multitron。ncRNA阵列式multitron中，有多个不同的底物可独立生成多个供体，但该设计存在质粒合成和组装困难的挑战。而msd阵列式multitron则将msr表达为单独的转录本，减少了编辑单元的大小和重复片段的长度。实验证明，msd阵列式multitron在编辑效率上与单重编辑无差异，且不受供体位置的影响，甚至能够同时编辑5个目标位点。
此外，研究人员还利用嵌套式multitron提高了删除大片段基因的效率。通过构建一系列嵌套的缺失供体，成功克服了重组过程中删除碱基对效率与编辑大小成反比的限制，实现了约42%的基因组中产生100bp的缺失。
在代谢工程方面，multitron也展现出了巨大的应用潜力。研究人员将与multitron重组相关的五个分子元件克隆到一个质粒中，并通过优化复制起点和诱导剂浓度，提高了编辑效率。利用multitron对番茄红素生物合成途径中的基因进行编辑，成功实现了所有位点的精确编辑，并且编辑效率随时间持续增加。通过对编辑后的细胞进行筛选和分析，发现不同菌落产生的番茄红素量各不相同，这表明multitron实验产生了多种基因型和相应表型。
在真核细胞中，研究人员通过替换核糖酶为Csy4识别位点和Csy4核酸酶表达，测试了Csy4对编辑单元和msd/cas9 gRNA单元进行基因组编辑的作用。结果表明，Csy4能够实现对非编码元件的加工，并且基于ncRNA/gRNAs阵列的真核multitron能够成功编辑多个位点。
总之，multitron技术为基因组编辑提供了一种强大的工具，它不仅优化了编辑效率，还为细胞和分子工作流程的实际应用提供了便利。这项技术有望在分子记录、基因元件最小化和代谢工程等领域得到广泛应用，为我们深入理解基因组的复杂性和推动生物技术的发展带来新的机遇。让我们期待multitron技术在未来的更多精彩应用和突破！
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