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5月29日，厦门大学刘亮课题组在线发表了“Trans-nuclease activity of Cas9 activated by DNA or RNA target binding”论文，该研究首次揭示了由crRNA和tracr RNA双RNA系统引导的II型Cas9蛋白具有反式核酸酶活性。打破了Cas9不具备侧切活性的传统认知，拓展了Cas9作为基因编辑工具以外在核酸检测方面的应用，为CRISPR核酸诊断提供了全新的一系列工具酶，有望进一步推动CRISPR在分子诊断领域的发展。
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设计并证明Cas9具有反式切割活性
以往研究表明，Cas12a和Cas12b都是使用RuvC domin特异性的切割dsDNA靶标和非特异性的切割ssDNA，Cas9也拥有RuvC domin，在Cas9中负责切割非互补DNA链（NTS链；互补DNA链称为TS链）。通过比较SpCas9与AacCas12b核酸酶的RuvC domin，作者发现Cas9与sgRNA和互补的ssDNA底物组装后，其HNH和RuvC催化结构域形成能够容纳TS链的通道（图1 a )。作者猜测Cas9 RuvC domin反式切割活性的激活可能需要序列和结构特异性的DNA底物与该通道结合。基于这一推测，作者首先分析了SpCas9-sgRNA-目标ssDNA三元复合物在非特异性同聚物ssDNA底物上的结合偏好，最终发现SpCas9偏好结合poly（T）和poly（C）序列（图1 b）。进一步的实验发现，SpCas9类似于Cas12a和Cas12b，可以反式切割poly（T）的ssDNA底物（图1 c，d )。
图1. Cas9可反式切割poly（T）和poly（C）ssDNA底物
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crRNA和tracrRNA依赖的ssDNA反式切割能力
作者发现分别使用嵌合的sgRNA和crRNA+tracrRNA的组合对顺式切割没有影响，然而，使用crRNA+tracrRNA双RNA的反式切割效率远强于用嵌合sgRNA的反式切割能力，可完全降解M13环状ssDNA（图2 d）。作者还发现SpCas9无法反式降解dsDNA，即dsDNA不能作为反式切割的底物（图2 e）。
图2. crRNA和tracrRNA guided反式切割活性
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DNA和RNA靶标均可激活反式切割活性
确定Cas9反式切割的激活底物要求：分别使用三种激活剂（靶标ssDNA、dsDNA和ssRNA）均能够激活反式切割活性（图3 a）；
确定Cas9反式切割底物要求：在激活剂分子存在的情况下，Cas9不仅能反式切割ssDNA，还能降解相应的ssRNA，但反式切割ssDNA的能力更强（图3 b）。
图3. Cas9反式切割的顺式底物和反式底物摸索
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建立两种基于Cas9的全新核酸检测平台
基于上述实验结果，作者开发了两款核酸检测平台：
（1）DACD（DNA-activated Cas9 Detection）核酸检测平台：利用核酸扩增技术和Cas9的靶向DNA激活的反式切割活性，用于目标DNA的检测（图4a）；
（2）RACD (RNA-activated Cas9 Detection) 核酸检测平台：利用RAA扩增和T7聚合酶依赖的RNA转录结合Cas9的靶向RNA激活的反式切割活性，用于目标RNA的检测（图4d）。
图4. Cas9介导的两款核酸检测平台
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总结
1、揭示了Cas9具有反式切割活性，并且靶标ssDNA，dsDNA，ssRNA都能够激活其反式切割活性；
2、发现靶DNA和靶RNA结合都可以触发Cas9的ssDNA和ssRNA反式切割活性；
3、构建了可以检测靶标DNA的DACD检测平台和检测靶标RNA的RACD平台，有望与其他核酸检测平台联用，实现多重检测。
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