CRISPR文库应用案例 | PNAS：高密度 CRISPRi 筛选揭示蓝藻适应环境新路径

蓝藻作为最古老的光合生物，参与着地球上几乎每一个栖息地的初级生产过程，是生态系统中不可或缺的一环。蓝藻的生长高度依赖于一系列动态调节的生化途径，这些途径就像精密的仪器，帮助蓝藻在复杂多变的环境中生存。当环境中的光照、温度、营养物质等因素发生变化时，蓝藻细胞内的转录调控机制就会迅速启动，通过调整蛋白质的浓度来适应新的环境条件。同时，蓝藻还能对不同颜色的光做出响应，通过改变核心光合组件的化学计量比，提高自身与入射光波长的光谱兼容性。对于温度的变化，蓝藻则依靠脂肪酸去饱和酶的表达改变，来调整细胞膜的流动性。

以往研究蓝藻基因功能虽然能揭示一些影响蓝藻生长的基因，但大多聚焦于生成基因特异性分类器，忽略了适应性效应的转录依赖性。而 CRISPRi 技术，凭借其能够产生中等水平转录抑制的独特优势，为研究系统滴定的生化调整对生物适应性的影响提供了有力工具。

研究人员以快速生长且具有工业相关性的聚球藻（Synechococcus sp. PCC 7002）为研究对象，构建了高密度的单导向 RNA（sgRNA）文库，每个基因约对应 10 个 sgRNA。在设计 sgRNA 时，考虑了多个因素，既要最大化种子序列的独特性，又要最小化其与编码链起始密码子的距离，以此来增强转录抑制效果。最终构建的文库中，98.8% 的基因都拥有 10 个不同强度的 sgRNA。

为了让这些 sgRNA 发挥作用，科研人员将编码 dCas9 的基因和 sgRNA 文库整合到 PCC 7002 细胞的基因组中，并置于诱导型启动子的控制之下。随后，他们将细胞文库置于不同的环境条件下培养，包括不同温度（22°C 和 37°C）和不同光照（连续白光、红光、蓝光以及昼夜白光）。培养结束后，利用下一代测序（NGS）技术测量 sgRNA 分布的变化，通过分析 sgRNA 的富集或耗竭情况，来判断基因转录抑制对蓝藻生长适应性的影响。

1、全基因组 CRISPRi 筛选揭示 sgRNA 的条件特异性富集

在不同环境条件下培养蓝藻细胞文库后，科研人员发现，许多基因的 sgRNA 出现了条件特异性富集或耗竭的现象。在 37°C 时，细胞在红光和连续白光下的生长速度明显快于蓝光和昼夜白光。而当温度降低到 22°C 时，所有光照条件下细胞的生长都明显放缓，尤其是在红光和蓝光下，细胞生长速度比在持续白光下慢约三倍，这表明 PCC 7002 在寒冷单色光条件下生长适应性较差。

进一步分析发现，超过一半在至少一种条件下出现 sgRNA 耗竭（表明存在适应性缺陷）的基因，在对 S. elongatus PCC 7942 的 Tn-Seq 分析中被认为是必需基因；而许多其他基因（约 39%）则被认为是非必需基因。对于那些没有 sgRNA 耗竭（包括出现富集）的基因，只有一小部分（约 11%）在 PCC 7942 中被归类为必需基因，大多数是非必需基因。这些不一致的结果可能是由于基因在不同生长条件下的条件必需性、CRISPRi 对基因的不完全敲低，或者物种间基因功能冗余的差异导致的。

图1  全基因组CRISPRi筛选揭示了PCC 7002中sgRNA的条件特异性富集

2、寒冷条件下蓝藻对蓝光和红光的转录敏感性差异

研究人员重点研究了一些与光感知、光合作用和冷休克相关的基因，发现这些基因的 sgRNA 在 22°C 的红光（22R）和蓝光（22B）条件下呈现出截然不同的富集模式。与光系统 II（PSII）和藻胆体相关的基因（如 apcE 和 apcB）在红光下 sgRNA 显著富集，而在蓝光下则没有；与光系统 I（PSI）以及适应寒冷或高强度光相关的基因，仅在蓝光下出现富集。与昼夜节律和 NDH - 1 相关的基因在两种条件下都有富集，但富集程度因光的颜色而异。

通过 k - 均值聚类分析，研究人员将基因分为五个具有不同适应性效应的组，分别为主要耗竭组、次要耗竭组、红色富集组、蓝色富集组和普遍富集组。对这些组进行基因本体（GO）分析发现，不同组之间的 GO 类别几乎没有重叠，这表明蓝藻对不同环境极端条件的应激反应和缓解机制存在明显差异。

图2  寒冷条件引起对蓝光和红光的不同转录敏感性

3. NDH - 1 亚基的富集谱在不同环境条件和复合物亚型间存在差异

NDH - 1 是一个在光合作用、呼吸作用和二氧化碳摄取过程中发挥重要作用的复合物。科研人员发现，其核心亚基对 sgRNA 表现出广泛的敏感性，而特定亚型（1L、1MS 和 1MS′）的亚基则没有。在 22R 条件下，针对亚型特异性亚基的 sgRNA 没有富集，这表明提高适应性可能需要减弱多个生化过程；而在 22B 条件下，抑制 1MS′特异性亚基（参与组成型二氧化碳摄取）对蓝藻生长有利，这暗示着蓝藻的适应机制可能是为了优化光谱质量和二氧化碳浓度的相关变化（图3A-B）。

图 3 中等程度的转录抑制可在寒冷窄光谱条件下提高适应性。（A）在 22B 和 22R 条件下，靶向 NDH - 1 核心亚基的 sgRNAs 的富集分布情况；（B）核心亚基对 CRISPRi 抑制的敏感性

4. 富集梯度揭示中等程度的转录抑制可提高适应性

在 NDH - 1 的核心亚基中，ndhC 和 ndhG 对转录抑制的敏感性最高。在 22R 条件下，针对这两个基因的 sgRNA 呈现出抛物线形的富集模式，中等程度的转录抑制可提高蓝藻对该条件的适应性；在 22B 条件下，富集程度与 sgRNA 的强度呈反比，低水平的转录抑制有利于蓝藻生长。科研人员通过实验进一步验证了这一结论，他们构建了含有不同强度 sgRNA 的 PCC 7002 菌株，以及通过 IPTG 调节强 sgRNA 表达水平，结果都表明中等强度的转录抑制能够提高蓝藻在 22B 条件下的适应性。

为了更精确地研究转录抑制的最佳水平，科研人员还使用了错配 CRISPRi 技术。通过在高活性 sgRNA 的 PAM 远端添加突变，减弱转录抑制强度，他们发现针对 ndhG 和 ndhB 的错配 sgRNA 能够绘制出更详细的适应性图谱，进一步证明了适应性梯度的复杂性，以及错配 CRISPRi 技术在研究转录调控中的重要作用（图 3C-G）。

图 3 中等程度的转录抑制可在寒冷窄光谱条件下提高适应性。（C）在寒冷单色光条件下，靶向 ndhC 和 ndhG 的 sgRNA 的 Log₂FC 值与 37W 条件下的相关性；（D）验证了 37W 条件下 sgRNA 富集与转录抑制（mRNA 水平）的相关性；（E）通过实验展示了不同强度 sgRNA 和不同诱导水平对 ndhG 基因的影响；（F）展示了不同蓝光强度下，特定 sgRNA 文库中 sgRNA 频率的变化；（G）利用错配 CRISPRi 技术展示了靶向 ndhG 和 ndhB 的 sgRNA 的富集模式

5. 寒冷单色光条件导致光系统 I 和 II 之间的不平衡

在极端寒冷的温度下，科研人员利用低温（77K）荧光光谱技术研究了 PCC 7002 的光系统 I（PSI）、光系统 II（PSII）以及它们之间的耦合藻胆体（PBS）。结果发现，在 22B 条件下，PSI:PSII 的比值相对于 22W 显著降低，而在 22R 条件下则保持不变。蓝光增加了游离 PBS 和 PSII - PBS 复合物的比例，这种变化与 PCC 6803 在蓝光下的表现相似，可能是由于 PSI 过度激发导致的。为了应对这种光系统不平衡，细胞会将 PBS 与 PSII 耦合（状态 1），但由于 PBS 对蓝光的吸收效果不佳，这种补偿作用有限（图4A-C）。

图4  不同程度的 ndhG 抑制可以减轻或增强冷单色条件引发的应激反应

6. 抑制 ndhG 在 22B 条件下增强一般应激反应

在循环电子传递（CET）过程中，NDH - 1 从 PSI 的受体侧接受电子并转移到质体醌（PQ）池，产生 ATP。抑制 ndhG 可能会影响这一过程，对细胞产生毒性。研究发现，在 22B 条件下，低强度的 sgRNA 抑制 ndhG 能够增加叶绿素 a 和藻蓝蛋白的吸收峰，而中等和高强度的 sgRNA 则会降低这些吸收峰。这表明轻微抑制 ndhG 能够增强细胞对 22B 条件的天然应激反应，而高强度抑制则可能会增强细胞应激，减弱这种反应。

通过定量蛋白质组学分析，研究人员还发现许多蛋白质的丰度在 22B 和 22W 条件下存在显著差异。随着 ndhG 抑制程度的增加，核心 PBS 蛋白和铁处理蛋白的相对丰度降低，核糖体蛋白在所有抑制水平下都被消耗，而 DNA 修复和高光诱导蛋白的相对丰度则增加。这些结果表明，在 22B 条件下，轻微抑制 ndhG 可能会引发一般应激反应，且随着抑制程度的增加，这种反应可能会变得更加有害（图4D-I）。

7. 双基因转录调整表现出非线性效应

研究人员利用双导向系统研究了转录效应对适应性的叠加性。如图5所示，他们选择了两对在 22R 或 22B 条件下 sgRNA 显著富集的基因（gap2 和 psbB；trpS 和 psaC）进行组合抑制实验。结果发现，组合转录效应是非线性的。在 22R 条件下，同时抑制 psbB 和 gap2 的生长速率比单独抑制 gap2 更慢；但当降低诱导剂浓度时，情况则相反，单独或组合抑制 psbB 能够产生最高的生长速率。在 22B 条件下，抑制 trpS 和 psaC 的生长速率因导向顺序和诱导剂浓度而异，表现出对转录抑制水平的极端敏感性。这表明转录抑制的精确水平对蓝藻的适应性起着决定性作用。

图5 双重敲低表现出非线性效应

本研究利用高密度全基因组 CRISPRi 筛选技术，全面评估了不同温度和光谱质量条件下，中等水平转录抑制对蓝藻生长的影响。研究发现，在寒冷单色光条件下，许多基因的敲低能够提高蓝藻的适应性，且这种效应与转录抑制的程度密切相关。同时，还发现低温和单色光的影响是非加性的，大多数提高适应性的敲低效应只有在这两种压力同时存在时才会出现，这暗示了蓝藻自然适应机制的局限性。此外，本研究中双基因组合实验展示了双基因调整的复杂性，其适应性效应相对于单基因变化是非加性的，且对 sgRNA 的排列和诱导水平敏感。这突出了遗传背景在转录调控中的重要性，也为未来利用大规模双导向筛选揭示意想不到的协同效应，以及基于联合抑制未注释基因和已注释基因的适应性效应为未注释基因赋予功能提供了研究方向。

参考文献

Andrew Hrena, Nicole Lollinia, Dana L. Carper, et al. High-­density CRISPRi screens reveal diverse routes to improved acclimation in cyanobacteria [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2025, 122 (12): e2412625122.]