FDA/CDE双认证！舒桐科技推出超高精度转座子整合位点检测方案！

在基因治疗和细胞工程快速发展的今天，转座子载体系统（如Sleeping Beauty、PiggyBac和Tol2）凭借其构建简单、容量适中、无病毒包装需求等优势，成为了众多治疗方案中的关键工具。随着转座子载体在临床应用的不断深入，监管机构对其整合安全性的关注也日益提高。2023年，美国FDA在多项基因治疗指南中进一步强调了对包括转座子在内的整合型载体系统进行全面风险评估的必要性^[1]。

中国药监局在一系列指导原则中同样明确强调了对转座子等基因修饰技术所采用的载体系统进行评估，分析潜在的插入突变和致瘤/致癌性风险的必要性。2021年发布的《基因修饰细胞治疗产品非临床技术指导原则（试行）》和2022年发布的《基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》均明确提出“基因插入位点和拷贝数需采用适用的检测方法进行研究，探索其与安全性和疗效的相关性”^[2,3]。

传统整合位点检测方法如标准LM-PCR、LAM-PCR在实际应用中面临假阳性率高、灵敏度不足等技术瓶颈，难以满足日益严格的监管要求。针对这一行业痛点，舒桐科技开发了基于Tn5转座酶的高精度整合位点分析技术—Tn5-LM-seq，为转座子介导的基因治疗产品的整合安全性评价提供了可靠解决方案。

表1. 关于载体整合风险评估的相关指导原则

Tn5-LM-seq技术是一种高灵敏度的整合位点检测方法，通过创新性地结合高活性Tn5转座酶和支持双向转座子末端反向重复序列（ITR）捕获策略，实现了对转座子载体整合位点的高精度检测。该方法首先利用Tn5转座酶对基因组DNA进行片段化，同时在片段两端添加含有独特分子标识符(UMI)的接头序列；随后，针对转座子末端序列设计特异性引物，进行两轮巢式PCR扩增，富集含有转座子-宿主连接点的目标片段；最终，通过高通量测序和专业生物信息学分析，利用UMI信息校正PCR扩增偏好性，精确鉴定整合位点的染色体坐标和功能特征。

Tn5-LM-seq技术支持灵活的检测方案：客户可根据项目需求选择仅针对单端（5'ITR或3'ITR）进行检测，也可同时进行双端建库分析以获得更全面的整合位点验证。双端检测方案通过对转座子两端与宿主基因组连接区域的独立捕获，提供了更可靠的整合位点确认和更详细的分子特征分析。

图1 Tn5-LM-seq检测原理示意图

1.1 Tn5转座酶一步法建库技术

采用高活性Tn5转座酶替代传统DNA片段化和连接步骤，实现基因组DNA酶切与接头连接的同步进行，相比传统方法：

（1）显著减少样本处理步骤，降低实验操作误差；

（2）避免中间片段的不特异性拼接，从根本上减少假阳性率；

（3）减少分子中间产物损失，提升低丰度整合位点检出灵敏度；

（4）整体工作流程缩短60%，样本处理时间从3天降至1天。

1.2 转座子末端序列双向捕获验证策略

针对不同类型转座子（如Sleeping Beauty、PiggyBac、Tol2）末端序列的特征，我们提供灵活的检测策略：

（1）单端检测选项：可针对转座子5'ITR或3'ITR任一端设计特异性引物，进行嵌套PCR扩增，适用于特定实验目的或预算考量的场景；

（2）双端检测方案（推荐）：同时针对转座子5'ITR和3'ITR两端分别设计特异性引物并进行独立建库分析，优势包括：

• 双向验证消除单向扩增可能引入的假阳性结果，提高准确率；

• 有效捕获病毒-宿主基因组连接区段，确保整合位点判定的可靠性；

• 支持整合事件的分子特征分析，揭示可能的整合机制。

1.3 UMI分子标记精准定量技术

在扩增初始阶段引入独特分子标识符(UMI)标记技术，实现对原始模板分子的精准追踪：

（1）有效消除PCR偏好性扩增导致的假阳性位点和定量误差；

（2）提供更准确的整合位点频率分析，支持克隆性评估；

（3）实现单分子级别的整合事件追踪，检测灵敏度达0.001%(即10万个细胞中检出1个整合事件)^[4]。

1.4 方法学验证与性能指标

舒桐科技严格遵循ICH Q2(R1)^[5]及FDA生物分析方法验证指南^[6]，对Tn5-LM-seq技术进行了全面系统验证。对比WGS、nrLAM-PCR、液相杂交捕获和Tn5-LM-seq四种方法的系统性验证结果表明，Tn5-LM-seq在各项技术指标上表现最优：

2.1应用场景

Tn5-LM-seq技术在转座子介导的基因治疗产品研发与监管过程中的应用场景广泛：

（1）转座子系统安全性评价：精确检测转座子介导的细胞工程中整合位点分布，对比不同转座子系统（如Sleeping Beauty、PiggyBac、Tol2）的整合特性与安全风险；

（2）基因治疗产品IND申报支持：提供符合监管要求的整合位点分析与方法学验证报告；

（3）临床随访研究：支持产品上市后的长期安全性监测与评估。

2.2 服务优势

（1）技术领先：自主研发的Tn5-LM-seq技术突破传统方法局限，提供更准确、更全面的整合位点分析；

（2）认证质量管理：实验室同时运行ISO9001质量管理体系、ISO/IEC17025测试和校准实验室能力认可标准及CANS（中国合格评定国家认可委员会）认证，确保数据可靠性与完整溯源性；

（3）全套方法学验证：已完成灵敏度、特异性、准确性、精密度等全面方法学验证，验证报告可直接支持IND申报；

（4）规范化报告体系：符合CDE、FDA最新指导原则要求的整合位点分析报告，全面支持药品审评与监管检查；

（5）丰富成功案例：已帮助多家领先企业完成转座子介导的基因治疗产品整合安全性评价及IND申报支持，积累了丰富的项目经验和审评理解。

舒桐科技提供符合监管要求的全面转座子整合位点分析报告，包含详细的测序数据质量评估、样本测序深度统计、与参考基因组比对分析及整合位点数量统计等基础信息。除此之外，报告还包含以下核心内容：

（1）整合位点检测结果及基因组序列：展示整合位点在宿主基因组中的精确坐标及病毒-宿主连接序列特征。

（2）整合位置基因注释结果：分析整合位点在基因组功能元件中的分布情况，包括外显子、内含子、启动子等区域。

（3）Oncogene注释：重点标记与致癌基因和抑癌基因相关的整合位点，评估潜在安全风险。

（4）基因功能分析：对发生整合的基因进行GO和KEGG通路富集分析，评估潜在生物学影响。

Sample-1 GO富集通路图

Sample-1 KEGG富集通路图

*服务周期：标准流程20-30个工作日；

*注：①所有样本必须符合上述质量标准，以确保检测结果的准确性和可靠性；②客户也可以寄送细胞渣样本用于DNA提取，细胞渣要求>2×10^7/位点；③对于特殊样本类型，请提前与舒铜技术团队沟通。

珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，总部位于粤澳深度合作区——横琴新区，下设鼓润（武汉）医疗科技有限公司、广州舒桐医疗科技有限公司和杭州舒桐生物科技有限公司等全资子公司。公司为国家高新技术企业，拥有博士后工作站和多个博士后团队，已申请专利40余项，承担多项国家科技重大专项。公司致力于通过创新技术为多种疾病尤其肿瘤开展新药研发，提供基因靶向治疗方案。同时公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案；具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐医疗坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。

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参考文献

[1] FDA. (2024). FDA requires warnings about secondary malignancies for BCMA-directed and CD19-directed autologous CAR T cell immunotherapies.

[2] 国家药监局. (2021). 基因修饰细胞治疗产品非临床技术指导原则（试行）.

[3] 国家药监局. (2022). 免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）.

[4] Yin J, et al. (2019). Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing. Cell Discov 5, 18.

[5] 国际人用药品注册技术协调会. (2005). ICH三方协调指导原则：分析方法论证：正文和方法学 Q2(R1) [现行第4阶段版本].

[6] 美国食品药品监督管理局. (2018). 生物分析方法验证：行业指南. 美国卫生与公共服务部食品药品监督管理局药品评价和研究中心与兽医药品中心.

[7] Corre, G., et al. (2023). Evaluation of diversity indices to estimate clonal dominance in gene therapy studies. Molecular Therapy Methods & Clinical Development, 29, 418-425.