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Science｜T7-ORACLE助力大肠杆菌连续超突变与加速进化

舒桐科技

2025-11-07

导读：点击蓝字关注我们11.7在合成生物学领域，加速蛋白质功能的进化是一个核心挑战。传统定向进化方法依赖体外诱变，过程繁琐且效率有限。

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11.7

在合成生物学领域，加速蛋白质功能的进化是一个核心挑战。传统定向进化方法依赖体外诱变，过程繁琐且效率有限。发表于《科学》杂志的一项研究中，Christian S. Diercks等人开发了一种基于T7噬菌体复制体的正交复制系统——T7-ORACLE，实现了在大肠杆菌中对目标基因的连续超突变，为蛋白质进化提供了强大工具。本文将详细解读该系统的构建、优化及应用成果，并结合所有图片结果进行科学分析。

研究背景与创新点

生物体的自然突变率极低（约10^-10 substitutions per base pair, spb），限制了实验室尺度下的基因多样化。传统定向进化通过误差倾向PCR等体外诱变技术引入突变，但过程耗时且难以实现连续进化。T7-ORACLE系统的创新在于利用T7噬菌体的正交复制机制，在保留宿主基因组完整性的同时，对特定质粒进行高效突变，突变率高达1.73×10^-5 spb，比基因组背景突变率提高10万倍。该系统结合大肠杆菌的快速生长和高转化效率，可无缝集成于标准分子生物学流程。

T7正交复制系统的建立

研究团队基于大肠杆菌BW25113菌株，通过转基因表达T7复制体的四个关键蛋白（gp1 RNA聚合酶、gp2.5 ssDNA结合蛋白、gp4解旋酶-引物酶、gp5 DNA聚合酶），构建了正交复制系统。初期实验发现，仅含T7复制起点的质粒无法稳定复制，而引入水解酶缺陷型T7溶菌酶（C131S突变体）与T7 RNA聚合酶的融合蛋白后，成功激活了复制起始。该系统使用qOR复制起点，并采用核酸外切酶缺陷的T7 DNA聚合酶（Δ28突变体），实现了质粒的稳定复制（>2周）。

图1结果分析：该系统展示了正交复制的可行性，质粒拷贝数为8.5，转化效率高达2.4×10¹⁰ cfu/μg，远超线性质粒系统（如OrthoRep）。突变率分析证实了靶向诱变的特异性（质粒突变率3.31×10-8 spb，基因组突变率3.66×10^-10 spb）。

T7 DNA聚合酶的定向进化提升突变率

DNA复制的高保真性源于三个机制：碱基选择（~10^-5 spb）、核酸外切酶校对（~10^-2 spb）和宿主错配修复（~10^-3 spb）。研究首先利用Δ28突变体消除校对功能，使突变率提高25倍（至3.31×10^-8 spb）。随后，通过定点饱和突变库筛选，在聚合酶活性中心鉴定了五个关键突变（V443K、N520M、P560V、Y24F、Q585R）。其中，N520M（O螺旋）和P560V（手指域铰链区）通过降低碱基配对约束提高突变率，而Y24F突变缓解了生长缺陷但不影响突变率。

图2结果分析：五重突变体（Δ28、N520M、P560V、V443K、Y24F、Q585R）的突变率升至1.73×10^-5 spb，突变谱分析显示过渡（如A:T→G:C）和颠换（如A:T→T:A）突变均无偏好性。正交性验证表明基因组突变率未受影响（4.4×10^-10 spb），且系统可稳定传代2周。

TEM-1β-内酰胺酶的连续进化应用

为验证实用性，研究针对TEM-1β-内酰胺酶进行了连续进化实验，拓展其对单环β-内酰胺（氨曲南）和头孢菌素类抗生素（头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟）的水解活性。将携带blaTEM-1基因的质粒转入T7-ORACLE菌株，在96个平行实验中逐步提高抗生素浓度（6天内增加1000倍）。

图3结果分析：所有抗生素实验中均观察到突变收敛（图3D-E）。例如，头孢噻肟耐药性进化中，G238S和E104K为主要突变，辅以启动子区突变（如pAmpR增强表达）及稳定性突变（M182T）。这些突变与临床分离株中扩展谱β-内酰胺酶（ESBL）的突变一致，证实系统能高效重现自然进化路径。

进化动力学的时间过程解析

通过纳米孔测序技术，研究分析了96个平行实验在每日传代中的突变动态。头孢噻肟实验中（图4A），G238S突变从早期富集，E104K在传代3后成为关键二级突变，后续出现M182T等稳定性突变。头孢他啶实验（图4B）则显示启动子突变早期出现，R164H/S与E104K协同作用，而D179G突变在高浓度下被竞争淘汰。

图4结果分析：时间过程数据揭示了进化路径的阶段性规律，例如启动子突变常早于编码区突变出现，表明表达水平调整是初期适应策略。这一发现为理解蛋白质进化动力学提供了高分辨率视角。

系统优势与展望

T7-ORACLE的核心优势在于：

环形质粒的高转化效率（2.4×10¹⁰ cfu/μg）支持预多样化库的整合
大肠杆菌快速生长（倍增时间<30分钟）加速实验周期
无需专用设备（如PACE系统）

研究还通过活性位点饱和库实验证明，起始于多样化库可探索更广泛的适应性景观，避免局部最优解陷阱。未来，通过诱导控制复制体蛋白表达，可进一步调控突变率和拷贝数。

结论

T7-ORACLE为连续进化提供了高效、灵活的平台，不仅适用于蛋白质功能优化，更有望用于新活性探索和适应性景观研究。这一系统将推动合成生物学、酶工程及抗生素耐药性研究进入新阶段。

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参考文献：

[1] Diercks CS, Sondermann P, Rong C, Gillis TG, Ban Y, Wang C, Dik DA, Schultz PG. An orthogonal T7 replisome for continuous hypermutation and accelerated evolution in E. coli. Science. 2025 Aug 7;389(6760):618-622. doi: 10.1126/science.adp9583. Epub 2025 Aug 7. PMID: 40773556.

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