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全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）正在成为临床诊断和生命科学研究的核心技术。随着精准医学的快速发展，如何获取高质量、无偏差的基因组数据成为关键挑战。PCR free WGS建库技术的出现，为这一难题提供了理想的解决方案。
为什么要做PCR Free WGS建库？
消除PCR扩增偏差，实现真实的基因组表征
传统WGS建库流程中的PCR扩增步骤是引入测序偏差的主要来源。Aird等人通过系统追踪6%-90% GC含量的基因组序列，明确证实PCR是建库过程中产生碱基组成偏差的主要源头[1]。这种偏差在极端GC含量区域尤为显著，导致这些区域的测序覆盖度严重不足甚至完全缺失。
对于具有极端碱基组成的基因组，如高AT含量的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum，AT含量>80%）和高GC含量的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis），传统PCR扩增方法会造成极不均匀的读段覆盖，严重影响基因组组装和变异分析[2]。
PCR free建库通过完全省略PCR扩增步骤，显著改善了GC-rich和AT-rich区域的测序覆盖。Kozarewa等人在2009年的开创性研究中证明，无扩增文库制备方法能够显著改善GC偏好性序列的比对和组装效果[3]。这使得研究人员能够更准确地解析启动子、CpG岛等重要功能区域。
大幅提升变异检测的灵敏度和准确性
在临床诊断应用中，变异检测的准确性至关重要。Zhang等人对NA12878标准样本进行的系统性比较研究显示，在平均测序深度约40×时：
同源SNPs检测灵敏度：>99.77%（PCR free）vs 较低的PCR-based方法
杂合SNPs检测灵敏度：>99.82%（PCR free）
阳性预测值：分别达到99.98%和99.07%
更重要的是，PCR free方法对插入缺失变异（indels）的检测灵敏度和阳性预测值也显示出显著改善。在该研究中，11例临床病例的19个已确认变异全部被PCR free WGS流程成功检测[4]。
显著提高测序数据的有效性
PCR扩增会产生大量的PCR重复reads，降低了测序数据的有效性。Chiang等人的研究表明，PCR free方法产生的unique reads（唯一读段）比例显著高于传统方法：
PCR free方法：96.4% unique reads
PCR方法：约85% unique reads
这意味着在相同的测序量下，PCR free方法能提供更多的有效基因组信息，减少数据冗余，提高测序资源的利用效率[5]。更高的unique reads比例对于准确估计拷贝数、检测低频变异至关重要。
提供更均匀的全基因组覆盖
测序覆盖的均匀性直接影响变异检测的完整性和准确性。研究表明，PCR free文库在整个基因组范围内提供更紧密分布、变异更小的覆盖深度[6]。
对于人类基因组中已知的低覆盖区域（大多数具有高GC含量），PCR free建库方法提供了最优的覆盖性能。这些区域包括许多重要的基因启动子，传统方法往往在这些区域表现不佳[7]。
优化拷贝数变异（CNV）检测性能
拷贝数变异是导致遗传性疾病的重要原因，占比5-10%[8]。PCR free建库因其均匀的覆盖特性，在CNV检测方面具有明显优势。
Chen等人针对217例临床样本的验证研究证实，基于PCR free的快速CNV测序方法（rCNV-seq）具有高灵敏度、高特异性和良好的可重复性，非常适合临床诊断实验室用于检测具有临床意义的拷贝数变异[9]。
此外，来自PCR free全基因组测序的CNV检测灵敏度至少与微阵列相当，在某些情况下甚至更高。这使得PCR free WGS能够在单一平台上同时检测SNV、indel和CNV等多种变异类型，简化了临床诊断流程[10]。
降低系统性错误，提高数据可信度
PCR扩增本身就是测序错误的重要来源。聚合酶在扩增过程中引入的碱基错误会随PCR循环次数增加而累积，最终被误认为真实的基因组变异[11]。
PCR free建库通过完全省略PCR步骤，从源头上消除了这类系统性错误，使测序数据更真实地反映样本的原始遗传信息。这对于精准医学应用，特别是检测稀有变异和低频体细胞突变时尤为重要。
更好的疾病相关基因覆盖广度
Zhang等人的研究还显示，PCR free建库在疾病相关基因的覆盖广度方面明显优于PCR-based方法[4]。这意味着在临床诊断中，关键的致病基因区域能够得到更完整、更准确的测序，有效降低因覆盖不足导致的漏检风险。
舒桐科技PCR Free WGS建库与测序服务
珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的创新型生物医药企业。凭借在基因组学领域的深厚技术积累和专业经验，公司现面向科研机构和临床诊断领域，提供高质量的PCR Free WGS建库与测序整体解决方案。
服务特色与技术优势
测序方案与应用场景
应用领域
完整服务流程
样本要求
交付内容
总结与展望
PCR free WGS建库技术通过消除PCR扩增偏差，实现了更均匀的基因组覆盖、更高的变异检测灵敏度和更准确的测序结果。大量文献研究证实，PCR free方法在SNP检测（灵敏度>99.7%）、indel识别、CNV分析以及极端GC含量区域的覆盖等方面均显著优于传统PCR-based方法。
随着测序成本的持续降低和技术的不断成熟，WGS正在成为分子遗传诊断的首选方法，能够在单一平台上捕获大多数基因组变异类型，消除了连续多次基因检测的需要。PCR free技术作为WGS的优选技术路线，将在精准医学时代发挥越来越重要的作用。
舒桐科技致力于为客户提供国际领先水平的PCR Free WGS建库与测序服务，以专业的技术、严格的质控和优质的服务，助力精准医学发展和生命科学研究突破。
参考文献
[1] Aird D, Ross MG, Chen WS, et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 2011;12(2):R18.
[2] Oyola SO, Otto TD, Gu Y, et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 2012;13:1.
[3] Kozarewa I, Ning Z, Quail MA, et al. Amplification-free Illumina sequencing-library preparation facilitates improved mapping and assembly of (G+C)-biased genomes. Nat Methods. 2009;6(4):291-295.
[4] Zhang Y, Yang X, Zhang Y, et al. Performance characterization of PCR-free whole genome sequencing for clinical diagnosis. Medicine (Baltimore). 2022;101(10):e28972.
[5] Chiang C, Layer RM, Faust GG, et al. PCR-free shallow whole genome sequencing for chromosomal copy number detection from plasma of cancer patients is an efficient alternative to the conventional PCR-based approach. J Mol Diagn. 2021;23(11):1612-1625.
[6] Lelieveld SH, Spielmann M, Mundlos S, et al. Comparison of exome and genome sequencing technologies for the complete capture of protein-coding regions. Hum Mutat. 2015;36(8):815-822.
[7] Quail MA, Smith M, Coupland P, et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 2012;13:341.
[8] Mikhail FM. Copy number variations and human genetic disease. Curr Opin Pediatr. 2014;26(6):646-652.
[9] Chen L, Liu P, Evans TC Jr, Ettwiller LM. A rapid PCR-free next-generation sequencing method for the detection of copy number variations in prenatal samples. Int J Mol Sci. 2021;22(5):2260.
[10] Muzzey D, Evans EA, Lieber C. Understanding the basics of NGS: from mechanism to variant calling. Curr Genet Med Rep. 2015;3:158-165.
[11] Aird D, Ross MG, Chen WS, et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biol. 2013;14(5):R51.
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