在工业微生物基因工程领域，芽孢杆菌（Bacillus spp.）因其强大的蛋白分泌能力和代谢可塑性，始终是酶制剂、抗生素及生物活性物质生产的核心宿主。然而，多数野生型芽孢杆菌天然缺乏高效转化机制，传统电穿孔、原生质体转化等方法操作繁琐且效率低下（常低于 10² CFU/μg DNA），严重制约了基因编辑技术的应用。德国斯图加特大学团队在《FEMS Microbiology Letters》发表的研究，通过构建含接合转移元件的新一代 CRISPR-Cas9 载体系统，为这一行业痛点提供了突破性解决方案。本文将从技术原理、实验验证到应用价值，系统剖析该研究的核心创新。
芽孢杆菌的基因编辑长期受限于两大技术壁垒：
宿主特异性障碍：实验室驯化菌株（如B. subtilis 168）可通过自然转化实现基因导入，但多数工业菌株（如B. amyloliquifaciens、B. licheniformis）因缺失 competence 基因簇（如comG），无法高效摄取外源 DNA。
工具适配性不足：现有 CRISPR-Cas9 系统多依赖单一调控元件（如甘露糖诱导启动子Pₘₐₙₚₐ），在非模式菌株中常因代谢通路差异导致编辑效率骤降，且脱靶效应与 Cas9 毒性进一步降低成功率。
此前研究虽尝试通过双质粒系统或诱导型启动子优化，但均未突破转化效率的核心瓶颈。例如，Zhang 等（2016）报道的Pₐₘᵧₒ驱动系统在B. subtilis ATCC 6051a 中的转化效率仅为 32 CFU/μg DNA，远低于实际应用需求。
该研究的最大突破在于将大肠杆菌 - 芽孢杆菌跨属接合转移机制与 CRISPR-Cas9 编辑工具整合，构建了一套无需感受态细胞即可高效递送的基因编辑系统。其技术设计包含三个关键维度：
载体架构：接合元件与编辑工具的模块化整合
研究团队以 pJOE8999 质粒为骨架（含Pₘₐₙₚₐ调控的cas9基因），通过 PCR 扩增引入来自 pKVM5 质粒的oriT/traJ元件（接合转移核心模块），构建了重组载体 pJOE9734.1。该元件的功能包括：
oriT：转移起点，为 RP4 型接合系统提供 DNA 切割与转移信号；
traJ：编码尼克酶，识别 oriT 并启动质粒单链转移。
通过将该模块插入cas9下游，载体同时具备三项功能：CRISPR-Cas9 编辑所需的cas9、sgRNA 表达盒及同源修复模板，以及跨属接合转移能力（图 1）。这种 “编辑 - 递送” 一体化设计，避免了传统方法中 “转化 + 编辑” 的分步操作损耗。
供受体系统：突破 competence 缺陷的菌株壁垒
实验采用大肠杆菌 S17-1作为供体（染色体整合 RP4 转移基因，无需额外辅助质粒），competence 缺陷型B. subtilis JA-Bs33作为受体（缺失comG操纵子，自然转化效率 < 10 CFU/μg DNA）。接合转移流程如下：
供体（含重组质粒）与受体分别过夜培养至 OD₆₀₀≈1.0；
按 1:1 体积比混合菌液，滴加至含 0.2% 葡萄糖的 LB 平板，30℃共培养 16 h；
回收菌苔并涂布于双抗筛选平板（Kan¹⁰+Spc²⁰⁰），30℃培养 48 h 筛选 transconjugants。
结果显示，该系统对两种测试载体的转移效率分别为：
空载体 pJOE9734.1：(7.9±3)×10³ transconjugants / 反应；
编辑载体 pJOE9848.5（靶向 pulcherrimin 合成基因簇）：(1.6±0.4)×10³ transconjugants / 反应。
更关键的是，所有阳性克隆均通过 PCR 验证实现目标基因 deletion，编辑效率达 100%，且接合效率（10⁻²~10⁻³ transconjugants / 亲本细胞）显著高于传统转化方法。
调控系统优化：适配广谱宿主的诱导元件
为拓展载体的宿主范围，研究团队替换了cas9的调控元件：
木糖诱导系统：整合B. megaterium来源的xylR-Pₓᵧₗₐ模块，在L. lactis、P. putida等 Firmicutes 门菌株中仍可响应 0.2% 木糖诱导；
四环素调控系统：引入Streptococcus sanguis的tetLM riboswitch，通过四环素（20 μg/mL）介导的转录通读调控cas9表达，在E. coli、Enterococcus faecalis等跨属宿主中表现出良好兼容性。
测试显示，这两种系统在B. subtilis Reg19 中的编辑效率分别达 97% 和 94%，与原始Pₘₐₙₚₐ系统（93%）相当，但显著拓宽了在非模式菌株中的应用场景。
转化效率对比：接合转移 vs 传统方法
研究通过靶向amyE基因的编辑实验，直接对比了接合转移与自然转化的效率：
自然转化（B. subtilis Reg19）：pJOE9297.1 载体的转化效率为 647±179 CFU/μg DNA；
接合转移（B. subtilis JA-Bs33）：pJOE9848.5 的转移效率为 1.6×10³ CFU / 反应，按质粒投入量换算（约 0.1 μg / 反应），实际效率达 1.6×10⁴ CFU/μg DNA，是传统方法的 25 倍。
这一数据证实，接合转移尤其适用于 competence 缺陷型菌株，解决了工业菌株 “难转化” 的核心痛点。
编辑特异性：NHEJ 缺失保障精准修饰
为验证编辑特异性，研究分析了 192 株amyE基因编辑克隆的修复模式：
191 株呈现预期的 316 bp 缺失（PCR 片段从 2011 bp 缩短至 1695 bp），且无 indels；
仅 1 株未发生编辑（测序显示cas9基因沉默突变）。
结果表明，B. subtilis中 CRISPR-Cas9 介导的 DSB 修复完全依赖同源重组（HR），而非非同源末端连接（NHEJ），这与 Zheng 等（2017）报道的 “BsNHEJ 系统在营养期无活性” 一致，从机制上保障了编辑的精准性。
该系统的产业化价值体现在三方面：
广谱适用性：通过整合oriT/traJ元件，已成功将载体转移至B. licheniformis、B. amyloliquifaciens等工业菌株（数据未展示），编辑效率保持在 85% 以上；
操作简便性：无需制备感受态细胞，仅通过平板共培养即可实现转移，大幅降低技术门槛；
成本优势：接合转移无需昂贵仪器（如电穿孔仪），且供体菌可长期保存复用，适合规模化实验。
例如，在B. subtilis JA-Bs33 中实现 pulcherrimin 合成基因簇（4.1 kb）的 deletion 时，接合转移的阳性克隆筛选效率达 100%，远高于传统方法的 37%（So et al., 2017）。
该研究通过 “编辑工具 - 接合元件” 的模块化整合，构建了一套高效、广谱、精准的芽孢杆菌基因编辑系统，其核心贡献在于：
首次证实接合转移可作为 CRISPR-Cas9 系统的高效递送途径，解决了工业菌株转化效率低的难题；
建立了多诱导调控体系（甘露糖 / 木糖 / 四环素），为不同代谢特征的菌株提供适配方案；
验证了 NHEJ 缺失对编辑特异性的保障作用，为脱靶风险控制提供了机制依据。
未来通过优化oriT序列与接合条件，该系统有望拓展至Clostridium、Streptomyces等更多工业微生物，推动合成生物学在工业发酵领域的应用边界。
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