Cell | 高效精确的基因组编辑：从千碱基到兆碱基尺度的应用！迭代重组酶技术！

舒桐科技

2025-08-11

导读：舒桐公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案

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基因组编辑技术近年来取得了显著的进展，尤其是在小范围的DNA修改（如插入、替换或突变）上取得了突破。然而，在植物和动物基因组的更大范围内进行精准的DNA修改仍然面临诸多挑战，包括编辑效率低、编辑范围有限，以及不可避免的“伤痕”序列（即重组位点遗留序列）。因此，开发一种能够在植物和人类细胞中实现无“伤痕”且高效的大规模DNA编辑工具变得尤为重要。

传统Cre-Lox系统的根本缺陷是可逆性难题：野生型LoxP位点的正/反向重组效率相当，导致编辑后DNA片段可能恢复原状；重组效率低：Cre酶的多聚化能力不足，限制了兆碱基级操作；脱靶效应：传统Lox变体（如Lox66/71）仅能部分降低可逆性。

本研究提出了两种创新的基因组编辑系统：可编程染色体工程系统（PCE）和无伤痕染色体编辑系统（RePCE）。这两种系统能够实现从千碱基到兆碱基尺度的大规模精确基因组编辑，克服了传统基因组编辑工具中的诸多问题。通过高通量筛选、AI辅助的重组酶工程以及Prime编辑技术的结合，研究团队成功开发了一种新的Cre-Lox系统，在植物和人类细胞中实现了精确的染色体级DNA修改。

技术进展与方法

1、重组位点库构建与Cre酶变体设计

在本研究中，作者首先设计了一种快速的重组位点（RS）库构建方法。通过在LoxP位点的左臂和右臂引入均匀的碱基突变，生成了多个Lox变体库。接着，作者采用AI辅助的Cre酶工程方法（AiCErec），通过计算机模拟预测Cre酶在不同变体中的表现，最终筛选出了能够显著提高重组效率且具有较低反转率的Cre变体。该方法大大提升了Cre酶的活性，最大化了重组效率。

2、可编程染色体工程系统（PCE）与RePCE系统

PCE系统的核心优势在于它能够通过设计特定的重组位点插入方向，实现大范围的DNA编辑，包括插入、替换、删除、反向、易位等类型的编辑。这一系统特别适用于基因组结构变异（SV）的精确控制，能够实现对植物基因组和人类细胞的高效编辑。

为了进一步提高编辑效率，作者结合了Prime编辑技术，并通过RePCE策略（使用RepegRNA）实现了无“伤痕”的染色体编辑。通过这一技术，研究人员不仅能够消除传统重组酶系统中残留的LoxP或其他重组位点，还能够避免因重组位点遗留而产生的潜在问题。

3、AI辅助重组酶工程（AiCErec）

为了克服传统重组酶无法进行有效“编程”的局限性，作者提出了AiCErec方法。该方法通过结合进化学与结构学的特点，优化了Cre酶的多聚体结构，提高了其在基因组编辑中的重组效率。经过AiCErec优化的Cre酶，其重组效率比野生型Cre酶提高了3.5倍，显著改善了其在大规模DNA编辑中的应用潜力。

实验结果与讨论

1、植物中的大规模DNA编辑

在本研究中，PCE系统被成功应用于多种植物基因组的编辑，尤其是在水稻、玉米和小麦中，研究团队实现了最大18.8 kb的DNA插入，最大发现了12Mb的基因组反转，并且实现了4Mb范围内的精准删除。这一成果标志着大规模基因组编辑技术的新突破，为作物分子育种提供了强有力的技术支持。

通过对比PrimeRoot系统，PCE系统在水稻、玉米和小麦中的编辑效率分别提高了2.3到5.3倍，尤其是在插入大规模DNA片段方面，PCE展现了明显的优势。

2、Cre酶变体的优化与应用

在优化Cre酶方面，AiCErec方法帮助研究人员开发了多种新型的Cre变体，这些变体表现出比传统Cre酶更高的重组效率。通过这些新变体，研究人员能够在植物细胞中成功地插入720 bp到2.4 kb的DNA片段，甚至在较为复杂的基因组区域也取得了优异的表现。进一步分析发现，这些变体在多个DNA插入点上的表现较为稳定，且能有效避免反向重组。

3、无“伤痕”编辑策略

RePCE系统的创新之处在于它能够通过RepegRNA技术，实现无“伤痕”编辑，即在完成大规模DNA编辑后，能够去除残留的重组位点序列。这一策略的成功应用，解决了传统重组酶系统中普遍存在的“伤痕”问题，使得基因组编辑更加精准。

关键技术突破：

PAMless设计：整合SpRY-Cas9（近乎无PAM限制），靶点覆盖率达98%（图5A）；
“rG”策略：在Lox序列侧翼引入NGG/CCN模体，使SpCas9可高效切除疤痕（图5H）。在图6的效率验证表明：在人类细胞中，GFP插入后疤痕清除率>90%。

4、在人体细胞中的应用

除了植物，RePCE系统在人体细胞中也表现出强大的编辑能力。研究人员通过在HEK293T细胞中进行实验，成功实现了大型DNA片段的插入、易位和反转，并且在编辑过程中，能够确保目标区域的基因组结构不发生其他不必要的改变。通过深度测序分析，研究人员证实了RePCE系统在人体细胞中实现了高达90%的“伤痕”去除效率。

附通用型设计工具：PCE Targets Designer在线平台（http://www.engineeringchromosome.cn），支持6种编辑类型（插入/删除/倒位/替换/易位/无疤痕）；自动化设计pegRNA，整合二级结构及脱靶预测。

结论与展望

本研究的技术突破为大规模基因组编辑提供了强有力的工具，尤其在植物分子育种、基因治疗和合成生物学等领域具有广泛的应用前景。尽管目前的编辑效率已达到较高水平，但仍存在一定的改进空间，特别是在人体治疗中的应用。未来的研究可以进一步优化Cre酶变体，结合更多的辅助因子（如IHF和FIS），并探索不同种类的重组酶，以实现更高效、更精准的基因组编辑。

此外，随着AI技术的进一步发展，基于AI的重组酶优化方法有望在未来实现更多蛋白质工程和基因编辑工具的突破。未来，PCE和RePCE系统将为大规模、精准的染色体级基因编辑提供更加丰富的应用场景，推动农业、医学和合成生物学的发展。

珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，熟练掌握各类基因编辑技术，包括基因编辑、碱基编辑及先导编辑等。公司搭建了一站式基因编辑平台，可提供从新型CRISPR开发、sgRNA靶点筛选、递送工具、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案。此外，基于CRISPR及Tn5转座酶技术可实现对不同微生物基因的快速敲除/敲入、过表达、定点突变及大片段删除等，实现定制化工程菌株的改造，如有需求，欢迎咨询。

关于舒桐

珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，总部位于粤澳深度合作区——横琴新区，下设鼓润（武汉）医疗科技有限公司、广州舒桐医疗科技有限公司和杭州舒桐生物科技有限公司等全资子公司。公司为国家高新技术企业，拥有博士后工作站和多个博士后团队，已申请专利40余项，承担多项国家科技重大专项。公司致力于通过创新技术为多种疾病尤其肿瘤开展新药研发，提供基因靶向治疗方案。同时公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案；具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐医疗坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。