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精准捕捉 Prime Editor 的潜在脱靶位点新方法：PEG-seq

舒桐科技

2025-09-29

导读：点击蓝字关注我们基因编辑是现代生命科学和医学中最具颠覆性的技术之一。

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基因编辑是现代生命科学和医学中最具颠覆性的技术之一。从最初的 CRISPR-Cas9 双链切割，到后续更温和的碱基编辑器（Base Editors, BEs）和先导编辑器（Prime Editors, PEs），科学家们正逐步实现对 DNA 的“精准改写”。然而，基因编辑进入临床面临的最大障碍之一就是脱靶效应（off-target activity）。传统的 Cas9 核酸酶会在基因组中产生双链断裂（DSB），如果错误发生在非目标区域，可能导致基因突变、染色体异常甚至潜在致癌风险。

对于Prime Editing而言，其工作机制依赖于 Cas9 H840A nickase（只切割单链 DNA）和逆转录酶，因此其脱靶形式主要表现为单链切口（SSBs, nicks）。然而，现有大多数脱靶检测方法（如 GUIDE-seq, CIRCLE-seq, CHANGE-seq 等）主要针对 DSB，对 单链切口的捕捉效率极低。这就形成了检测技术上的“盲区”。

因此，来自美国的研究团队开发了一种新的生化检测工具——PEG-seq（3′-end ligation sequencing），专门用于捕捉和定位基因编辑酶引起的单链切口，从而为 Prime Editing 的安全性评估提供重要工具。

PEG-seq 是怎么“盯住”DNA 单链切口的？

PEG-seq 的核心流程是：

消除背景噪音：基因组 DNA 中天然存在大量随机切口。研究人员先用聚合酶和链终止子 ddNTP “封住”这些背景切口，保证后续检测主要来源于编辑酶作用。
专门标记新切口：在编辑酶作用后产生的 SSB 上，直接连接一个带有生物素和随机接头的 Illumina 读段 1 适配子（adapter）。
捕获与扩增：通过链延伸、磁珠纯化和双端测序，将这些新连接的片段富集并进行高通量测序。
定位切口位点：读段 1 的第一个碱基正好对应于切口位置，从而可以实现单碱基分辨率的切口定位。

这种方法类似给 DNA“上锁并打标签”，确保每一个捕捉到的切口都真实对应编辑器的活性，而不是细胞背景噪声。

实验设计：从内切酶到 Prime Editor 的逐步验证

研究团队设计了一系列“层层递进”的实验来验证 PEG-seq 的可靠性和普适性：

验证模型酶：首先使用已知识别序列的 nickase 内切酶 Nb.BsrDI。PEG-seq 成功捕获其产生的上百万个切口，并重现了其识别序列 GCAATG，证明方法有效。
测试Cas9变体：比较了SpCas9全酶、SpCas9D10A（HNH 单切）、SpCas9H840A（RuvC 单切）三种变体，PEG-seq 清晰地区分了它们的切口活性与链特异性。
应用到 Prime Editor：将 PEG-seq 应用于 PE+sgRNA 体系，结果在基因组范围内检测到数千个潜在脱靶位点，其中许多与已知 Cas9 脱靶位点高度重合，同时也发现了 PE 特有的脱靶模式。

更有趣的是，作者发现 PE 在某些位点的切口位置会有 “chew back”现象，即逆转录过程中可能导致切口位置相对于预期位点有数个碱基的偏移，这提示了酶在体外可能存在更复杂的动态行为。

PEG-seq 揭示 Prime Editing 的脱靶全景

通过 PEG-seq，研究团队得出了几个关键结论：

高灵敏度捕捉：PEG-seq 能够检测到比传统方法更多的潜在脱靶位点（FANCF 和 RNF2 序列分别检测到 ~5000–9000 个脱靶信号）。
链特异性差异：SpCas9H840A（PE 使用的 nickase）在识别 PAM 近端时要求更严格，但在 PAM 远端（间隔区）容忍度更高，因而产生更多潜在脱靶。
与传统方法互补：PEG-seq 检测到的位点与 CIRCLE-seq、GUIDE-seq 有部分重叠，但也有其独特发现，说明它可以作为现有 DSB 检测工具的有力补充。
脱靶频率更低：在细胞实验证明，PE 的实际脱靶频率低于 SpCas9，说明 Prime Editing 在应用中可能比传统 Cas9 更安全，但仍需警惕个别高风险位点。

技术亮点与创新

PEG-seq方法创新：开发了一种新技术PEG-seq，能够精确识别prime editor引发的单链断裂（SSB）。
高效的离靶检测：PEG-seq能高效检测prime editor的离靶位点，比传统方法更适用于单链断裂。
Prime Editor离靶分析：PEG-seq识别出prime editor的离靶效应，且离靶较少，精度较高。
与SpCas9比较：与SpCas9变体比较，prime editor的离靶位点表现出不同的单链断裂模式。
通用性和优化：PEG-seq适用于多种引导RNA和编辑工具，优化后可以提高离靶效应的检测精度。

学术价值与应用前景

学术价值：

揭示了SpCas9不同结构域（RuvC vs. HNH）在序列识别上的差异；
发现PE在体外具有大量潜在脱靶位点，部分位点在细胞中得以验证；
为理解编辑器与DNA互作的机制提供了新视角。

应用前景：

药物开发：为基因编辑疗法的临床前安全性评估提供标准流程；
编辑器优化：指导更高特异性的PE变体设计；
基础研究：可用于研究DNA损伤、修复、复制等过程中SSB的分布与动态；
伴随诊断：未来或可开发为编辑器的脱靶风险评估工具。

总结，本研究开发的PEG-seq方法，首次实现了对Prime Editor等切口酶诱导的单链断裂的高灵敏度、全基因组检测，填补了现有脱靶检测技术的空白。通过严谨的体外与细胞验证，研究团队证明了PEG-seq在识别编辑器脱靶位点方面的有效性和可靠性。

尽管PEG-seq在灵敏度、特异性和通用性方面表现出色，但仍存在一些局限性，例如对低频事件的检测仍需高测序深度，细胞水平的应用仍需优化。未来，随着测序成本的降低和数据分析方法的进一步优化，PEG-seq有望成为基因编辑器安全性评估的金标准方法之一。

更重要的是，这项研究为我们理解基因编辑器与基因组的互作机制提供了新的视角，也为开发更安全、更高效的基因治疗策略奠定了坚实基础。随着更多编辑器变体的出现（如双PE、PASTE等），PEG-seq的应用范围将进一步扩大，推动基因编辑技术向临床安全迈进。

参考文献

[1] Stewart-Ornstein J, Irby MJ, Lilieholm MK, et al. 3′-end ligation sequencing is a sensitive method to detect DNA nicks at potential sites of off-target activity induced by prime editors. Genome Res. 2025;35:2064–2075.

关于舒桐

珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，总部位于粤澳深度合作区——横琴新区，下设鼓润（武汉）医疗科技有限公司、广州舒桐医疗科技有限公司和杭州舒桐生物科技有限公司等全资子公司。公司为国家高新技术企业，拥有博士后工作站和多个博士后团队，已申请专利40余项，承担多项国家科技重大专项。公司致力于通过创新技术为多种疾病尤其肿瘤开展新药研发，提供基因靶向治疗方案。同时公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案；具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐医疗坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。