一
前言：为什么要研究lncRNA的CRISPR筛选？
CRISPR干扰（CRISPRi）是当前发现功能基因的高通量工具，但在长链非编码RNA（lncRNA）研究中仍面临挑战：
lncRNA功能效应微弱，信噪比低；
注释不完善，部分与蛋白编码基因或增强子重叠；
容易出现假阳性结果。
本文作者提出了一种“简化并行扰动方案”：
通过细胞类型特异性的双sgRNA文库，在多种条件下同时进行lncRNA功能筛选。该方案让研究者以更高效率、更低成本探索lncRNA的细胞环境特异性功能。
图1：lncRNA CRISPR并行扰动整体流程
二
创新亮点一览
双sgRNA设计：提升敲低效率与特异性；
小型文库结构：便于多条件并行筛选；
细胞类型定制化：针对特定细胞的转录特征；
可扩展与复用：适合多类生物学问题与条件比较。
三
核心实验步骤
Step 1：设计双sgRNA文库
图2：双sgRNA与单sgRNA敲低效率对比图
选择目标lncRNA
以SNHG6为例（K562细胞系）：
表达水平高；
SNHG6 TSS(Transcription start site,转录起始位点)与最近的蛋白质编码TSS的距离大于1 kb；
启动子上有≥4个转录因子结合峰；
排除误注释与重复基因。
这些标准可确保选中的lncRNA在该细胞类型中具备较高功能潜力。
sgRNA设计策略
使用 CRISPick 平台；
设定参数：GRCh38 / CRISPRi / Spyo Cas9；
添加正负对照：10个必需基因 + 250个随机无靶点；
每个lncRNA设计≥6条sgRNA，两两配对形成双sgRNA；
确保序列无限制性内切位点（BstXI、Bpu1102I、Esp3I）。
✨✨✨ 小贴士：每条sgRNA开头需有“G”以保证U6启动子正常转录。
Step 2：克隆与构建文库
整个流程约2–12周，核心步骤包括：
载体消化与寡核苷酸合成；
PCR扩增与凝胶纯化（控制10–12循环）；
T4连接与电转入感受态细胞；
菌落PCR验证 + Sanger测序；
中量级放大与NGS质量评估。
✨✨✨ 推荐文库规模：不超过4000对sgRNA。这样既可保证覆盖度，又便于在多扰动条件中灵活使用。
Step 3：建立稳定CRISPRi细胞系
构建稳定表达dCas9的K562细胞：
使用带荧光标签的dCas9载体：
pHR-SFFV-dCas9-BFP-KRAB
pHR-UCOE-SFFV-dCas9-mCherry-ZIM3-KRAB
通过多轮流式分选纯化阳性群体；
也可通过抗生素筛选（如嘌呤霉素）获得稳定系。
验证敲低效果后再进入正式筛选阶段。实验中SYVN1与SEL1L基因敲低效率>90%。
图3：qPCR验证SYVN1与SEL1L敲低效果
Step 4：并行扰动筛选
在获得稳定细胞后，可同时测试多种条件：
每组需保持 ≥500–1000× 覆盖度，三次生物学重复。建议以流式检测BFP阳性比例或药筛纯度控制筛选一致性。
图4：扰动校准示例
Step 5：数据分析与验证
NGS数据分析
使用 MAGeCK 软件计算富集/耗竭基因；
对比正负对照sgRNA的表现；
检查重复间相关性（R² ≈ 0.96）。
结果验证与排除假阳性
确认sgRNA不影响邻近蛋白基因表达；
检查是否存在拷贝重复或增强子干扰；
将显著lncRNA单独验证（RT-qPCR + 生长竞争实验）。
图5：分析筛选结果和质控参数
四
结果与启示
双sgRNA设计显著增强敲低效果；
小型文库便于进行多条件并行扰动；
结合TF结合峰筛选，提升lncRNA命中率；
整体方案低成本、高可重复性，为研究细胞状态依赖的lncRNA功能提供了强大工具。
五
实验局限与优化建议
lncRNA注释不全 → 需结合TF峰/DNase位点信息；
某些细胞转导效率低 → 可考虑替代病毒系统；
sgRNA表达依赖启动子强度；
轻微效应lncRNA需延长扰动时间或提高覆盖度。
这篇发表于《STAR Protocols》的研究提供了一个可复制、可扩展的lncRNA CRISPRi并行扰动实验标准流程。
它通过“小而精”的文库与多扰动并行设计，成功解决了lncRNA研究中的高通量难题，让我们能更系统地探索非编码RNA在不同细胞状态下的真实功能。
参考文献
[1] Hazan J.M., Lahoud-Jeries N., Bester A.C. (2025). Protocol for simplified parallel perturbations using an abridged long non-coding RNA CRISPR library. STAR Protocols, 6(12): 104110.
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