基因编辑工具酶——Cpf1蛋白简介

俗话说，工欲善其事必先利其器，科研工作者想要准确地回答研究问题，选好、用好工具是十分重要的。CRISPR-Cas系统是基因编辑的重要工具，在生命科学领域被广泛应用。经过科研工作者的不懈努力，如今，CRISPR-Cas系统的种类越来越丰富、应用范围越来越广、效率越来越高、准确性越来越好^[1]。了解CRISPR-Cas这个工具箱中的各个工具，对基因编辑的相关工作是十分有好处的，今天我们就来聊聊其中的Cpf1蛋白。

首先，我们来聊聊CRISPR–Cas系统的大致分类。2020年，Makarova等科学家将CRISPR–Cas系统分成2类（Class），6型以及33个亚型，如图1。第一类包括I、III、IV型，该类型通过多种蛋白形成复合体来摧毁外源核酸；第二类包括II、V、VI型，该类型仅使用单个蛋白来切割DNA^[2]。

图 1 两类CRISPR–Cas系统^[2]

Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1)蛋白，也称为Cas12a蛋白^[3]，是第一个用于基因编辑的Cas12核酸酶^[1]。Cpf1是一种不需要tracrRNA的crRNA引导的核酸内切酶，它利用富含T的PAM、通过交错的DNA双链断裂来切割DNA^[3]，如图2。与常见的Cas9不同，Cpf1蛋白具有以下特点：具有RNase活性、识别富含T的PAM序列、产生黏性切割末端。

图 2 Cpf1蛋白^[3]

 图 3 Cas12a的顺式和反式切割活性

相对于常见的Cas9蛋白，Cpf1蛋白有以下几个方面的优点：

1、脱靶率低^[5,6]

在体外实验中，Kim等研究人员利用Digenome-seq技术，对经不同的基因编辑酶作用后的全基因组进行分析时发现：对于同一个crRNA，LbCpf1和AsCpf1分别有6个、12个脱靶位点，其数量远少于Cas9造成的脱靶(＞90个)。对crRNA的3′端4~6个碱基，Cpf1可以接受1~2个碱基与靶序列不匹配，对其余区域的碱基替换，则是零容忍。

2、Cpf1的DR序列更短，且Cpf1蛋白本身存在成熟crRNA的能力，因此更适合multiplex基因编辑。

3、 切割DNA后形成粘性末端。Cas9是在同一个位置同时剪切DNA分子的双链，形成的是平末端，而Cpf1剪切后形成黏性末端。平末端通常不容易处理，而粘性末端让DNA插入更可控。

1、多重基因编辑

Cpf1只需要crRNA就可以完成基因组编辑，且Cpf1能够独立介导pre-crRNA加工而不需要其他分子的介入，并且加工RNA的能力独立于DNA剪切的功能。利用Cpf1这种独特的特性，Zetsche等研究人员使用定制的CRISPR阵列，在HEK-293T细胞中实现了同时编辑DNMT1、EMX1、VEGFA、GRIN2b基因，以及在小鼠大脑中同时编辑DRD1，MECP2和NLGN33基因^[7]。

2、体外诊断

此外，Cpf1蛋白在基因治疗、遗传育种等方面也有广泛的应用^[5,11]。

珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，开发出了多种基因编辑相关的工具酶，其中就包括多种Cpf1蛋白。我们开发的AsCpf1和LbCpf1核酸酶，具有高纯度、高活性、无核酸酶污染等优点，可用于通过电转、脂质体转染等方式转到细胞中行基因编辑，还可注射到胚胎或动物体中进行体内基因组编辑。另外，本公司研发团队最新研发出一种具有独特“TTNA” PAM的LtCas12a核酸酶已经成功应用于人乳头瘤病毒HPV的快速诊断中，欢迎感兴趣的老师和同学们垂询！

珠海舒桐医疗科技有限公司深耕基因编辑技术10余年，是一家以基因编辑为核心技术的生物医药服务企业，可承接脱靶检测、细胞株定制、病毒包装等CRO及CDMO业务。目前，舒桐科技拥有3000㎡的GMP研发实验室及生产车间；拥有博士后科研工作站及澳门理工大学教学科研实习基地。研发团队熟练掌握各类基因编辑技术，包括基因编辑、碱基编辑及先导编辑等，成功完成如基因敲除、点突变、大片段插入、过表达等细胞系构建项目；开发了多种具有自主知识产权的脱靶检测技术，建立了高通量的sgRNA筛选平台；建立了工厂化新型CRISPR挖掘体系，已开发出多种切割效率高且低脱靶的新型CRISPR。公司目前已申请基因编辑、脱靶检测、新型CRISPR及药物递送等专利70+项，授权50+项。同时，公司具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐科技坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。

如需获得更多信息，请咨询我们：

电话：

400-6309596

15022705442（同微信）

企业官网：

http://www.generulor.com

产品订购/技术支持：

service@generulor.com

参考文献

[1] Liu G, Lin Q, Jin S, et al. The CRISPR-Cas toolbox and gene editing technologies[J]. Mol Cell, 2022, 82(2): 333-347.

[2] Makarova KS, Wolf YI, Iranzo J, et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants[J]. Nat Rev Microbiol, 2020, 18(2): 67-83.

[3] Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system[J]. Cell, 2015, 163(3): 759-771.

[4] Li T, Zhu L, Xiao B, et al. CRISPR-Cpf1-mediated genome editing and gene regulation in human cells[J]. Biotechnol Adv, 2019, 37(1): 21-27.

[5] Li T, Zhu L, Xiao B, et al. CRISPR-Cpf1-mediated genome editing and gene regulation in human cells[J]. Biotechnol Adv, 2019, 37(1): 21-27.

[6] Kim D, Kim J, Hur JK, et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells[J]. Nat Biotechnol, 2016, 34(8): 863-868.

[7] Zetsche B, Heidenreich M, Mohanraju P, et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array[J]. Nat Biotechnol, 2017, 35(1): 31-34.

[8] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6[J]. Science, 2018, 360(6387): 439-444.

[9] Chen JS, Ma E, Harrington LB, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity[J]. Science, 2018, 360(6387): 436-439.

[10] Li SY, Cheng QX, Wang JM, et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection[J]. Cell Discov, 2018, 4: 20.

[11] Jiang Y, Qian F, Yang J, et al. CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum[J]. Nat Commun, 2017, 8: 15179.