线粒体（mitochondrion）是一种存在于大多数真核细胞中的双层膜细胞器，是细胞代谢的能量工厂。在哺乳动物中，它几乎存在于除成熟红细胞以外的所有细胞，通过呼吸链和氧化磷酸化等过程产生ATP，为生命活动提供能量。
与高尔基体、内质网、溶酶体以及核糖体等其他细胞器不同的是，线粒体具有自己的遗传物质——线粒体DNA（mtDNA，mitochondrion DNA）。人mtDNA全长约16kb，具有自主复制、母系遗传、多拷贝，异质性高和突变率高等特点。mtDNA突变会导致包括Leber遗传性视神经病（LHON）和线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及卒中样发作综合症（MELAS）等在内的线粒体DNA突变疾病。目前，尚无特效的治疗方法。
线粒体特殊的膜结构阻碍了CRISPR/Cas系统中的引导RNA组分进入线粒体基质，纯蛋白组分的基于TALE/ZFP的TALEN/ZFN已被证实可高效进入线粒体并对靶突变mtDNA进行切割降解，但仍缺乏能够精确模拟突变或修复的单碱基编辑器。
2020年，美国哈佛大学与麻省理工学院Broad研究所的David R. Liu实验室首次开发出基于双链DNA胞嘧啶脱氨酶DddA的线粒体单碱基编辑器DdCBE，首次实现了线粒体DNA上的C/G到T/A的单碱基编辑转换（图1）1,2。
图1 DdCBE的工作原理
来源于伯克霍尔德杆菌（Burkholderia cenocepacia）的DddA在体内外展示了较强的TC胞嘧啶脱氨偏好性。随后定向进化的升级版DdCBE进一步提升了编辑效率和序列编辑范围3。但根据Mitomap数据库的报道4，线粒体DNA的GC突变是仅次于TC突变数量最多的一类突变类型，目前仍缺乏对GC具有较强编辑特性的dsDNA胞嘧啶脱氨酶。
2023年10月19日，Nature Communications在线发表了南京医科大学生殖医学与子代健康全国重点实验室的沈彬、张军实验室，与之江实验室的娄鑫合作的题为“Developing mitochondrial base editors with diverse context compatibility and high fidelity via saturated spacer library”的研究论文，该文章通过构建了无NC偏好性的Spacer文库筛选出了七个具有活性的DddA同源蛋白，扩展了线粒体DNA的单碱基编辑工具箱5。
图2 Spacer饱和文库鉴定双链DNA胞嘧啶脱氨酶
在鉴定dsDNA双链DNA胞嘧啶脱氨酶时，为了排除因单个或少数编辑位点所造成的序列偏好性，以及可能因此而疏漏的潜在低活性蛋白，研究者们设计了一个包含不同6xNNC（15个载体）、6xNCN（12个载体）、6xCNN（9个载体），以及两个内源性位点JAK2和SIRT6（2个载体）在内的一共38个载体组成的Spacer载体文库（图2）。
通过编辑这些丰富的NC碱基编辑类型及高通量测序，成功的鉴定到了七个具有双链DNA胞嘧啶脱氨酶活性的DddA同源蛋白。其中来自Lachnospiraceae bacterium sunii NSJ-8和Streptomycessp. BK438的DddA同源蛋白FZY2和Q2L表现出非常强的的GC序列偏好性，WC03表现出较强AC编辑活性。（图2）
有意思的是，通过表达TALE-Free的这些活性DddA同源蛋白进入线粒体并结合高通量全线粒体测序，研究者们不仅揭示了这些DddA同源物的保真性（FZY2的G28拆分保真性最优）以及序列偏好性，还发现了不同拆分位点对于dsDNA胞嘧啶脱氨酶的位点选择的重要影响作用（图3）。对DddI的关联挖掘进一步抑制了这些DddA同源蛋白的核内脱靶活性，提升了其安全性（图4）。
图4. DddA-DddI的正交抑制特性
总之，本研究通过开发NC序列饱和的Spacer文库，结合AlphaFold2以及高通量测序等方法，系统、高效、无偏差的筛选出七个具有dsDNA胞嘧啶脱氨酶活性的DddA同源蛋白。通过将FZY2应用于人线粒体DNA A8344G的细胞系修复，也体现了这些工具未来广阔的应用前景以及临床价值。
南京医科大学生殖医学与子代健康全国重点实验室的沈彬、张军、以及之江实验室的娄鑫为本文的通讯作者。南京医科大学生殖医学与子代健康全国重点实验室的孙海峰博士（现康奈尔大学博士后）、在读研究生王兆君、沈李宓妮、冯烨玲为本研究论文的共同第一作者。
1. Mok, B. Y. et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature 583, 631–637 (2020).
2. Mitochondrial genome editing gets precise. Nat. News Views (2020) doi:10.1038/d41586-020-01974-6.
3. Mok, B. Y. et al. CRISPR-free base editors with enhanced activity and expanded targeting scope in mitochondrial and nuclear DNA. Nat. Biotechnol. 40, 1378–1387 (2022).
4. Brandon, M. C. MITOMAP: a human mitochondrial genome database--2004 update. Nucleic Acids Res. 33, D611–D613 (2004).
5. Sun, H. Developing mitochondrial base editors with diverse context compatibility and high fidelity via saturated spacer library. Nat. Commun. (2023).
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