经典综述分享 | 华中农业大学系统阐述基因编辑脱靶效应产生原因、脱靶评估及降低脱靶的策略

舒桐科技

2024-01-12

导读：舒桐科技深耕基因编辑技术10余年，搭建了一站式基因编辑平台，为客户提供全面精确的基因编辑安全性检测和分析服务。

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基因组编辑（Genome Editing, GE）技术是当前生命科学研究的前沿领域，近年来发展迅猛。目前CRISPR/Cas9系统已用于治愈人类遗传病、实现细胞个性化治疗、开发新药、作物遗传改良等领域。但CRISPR技术存在的脱靶效应（Off-target effect）依旧是影响CRISPR技术能否广泛应用的主要限制因素，如何正确评估、检测脱靶效应，并提出相应的策略降低脱靶效应是当前基因编辑研究领域的重要研究方向。人们正在努力通过生成各种具有高保真度和准确性的CRISPR / Cas系统，来减少CRISPR / Cas9的脱靶效应。

2020年2月6日，国际知名学术期刊Advanced Science杂志在线发表了华中农业大学棉花遗传改良团队题为“CRISPR/Cas systems in genome editing: methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation and strategies to mitigate off-target effects”的综述论文，该文章利用当前的GE工具，总结了GE技术产生的脱靶效应，脱靶效应的类型，脱靶效应的机理，主要问题以及动植物的脱靶效应的结果。其中详细介绍了检测脱靶效应的方法，单向导RNA（sgRNA）设计工具，脱靶效应的评估和预测，以及提高脱靶效率和减轻脱靶对预期基因组编辑影响的策略。

1、基因编辑脱靶效应是如何产生的以及主要类型？

Cas9与DNA之间的相互作用首先是通过PAM位点的识别和结合来介导的，同时crRNA和潜在靶标编辑序列之间的结合进行定向反应，形成稳定的R-循环，进而激活酶切活性使PAM近端DNA断裂。当sgRNA序列识别出特定序列之外的部分错配而不是靶上位点时，就会产生脱靶效应（图2）。同时，许多关于脱靶的研究指出，错配的类型及其与PAM序列的距离非常重要。通过该信息可以开发出多种脱靶评分方法，从而有助于基于脱靶预测的gRNA选择。

图2 CRISPR/Cas 9 系统脱靶效应产生的机制

脱靶区以前被分为三种主要类型:

1、在其他pam (5 ' -NGG-3 ')上有替换或不匹配的区域。

2、其他PAMs (5 ' -NGG-3 ')的区域，与靶DNA或gRNA间隔段相比，这些区域包含插入和/或缺失(indels)DNA或RNA与残留的核苷酸形成一个小凸起，它们正确地退火，促进Cas9的活性。

3、然而，在这些地点检测到的脱靶活动有时高于靶活动第三种是剪切具有不同PAM位点(5 ' -NAG-3 ')的序列。

随后，也有人提出CRISPR有两种脱靶效应：

1、第一类是与靶标序列相似性较高的基因组区域的预期脱靶，也就是sgRNA依赖型脱靶。

2、第二种类型包括与靶标无关的基因组区域的意外脱靶，也就是sgRNA非依赖型脱靶。

2、为什么要关注基因编辑脱靶问题？

CRISPR / Cas9系统在基因组编辑中显示出巨大的潜力，但其脱靶可能给宿主生物带来严重的问题。脱靶可以导致染色体重排，在不完全匹配的基因组处造成损伤，并限制了GE在人类医学研究上的应用。除干扰染色体稳定性外，脱靶效应还可能导致功能基因活性的丧失，从而导致各种生理或信号异常（图1）。

在植物中，CRISPR/Cas9已在超过30种植物物种和数百个基因实现成功编辑。与人类的基因疗法和临床研究不同，植物研究不受伦理学问题的影响，并且对GE的脱靶效应的耐受性可能更高。虽然对于植物脱靶效应可以通过育种过程表型筛选来消除脱靶突变或自发突变，但对科学问题的研究依然带来很大的不确定性。因此非常有必要对基因组编辑中存在的脱靶问题进行系统分析，为未来更加高效、精准地利用基因编辑技术提供理论依据及解决方案。

在动物中，当CRISPR/Cas系统不仅切割目标区域时，可能会产生不可预见的脱靶编辑，并可能造成潜在的有害影响，例如激活癌基因。如前所述，脱靶突变可能导致基因组不稳定，破坏基因功能。Sgrna依赖和非依赖事件可影响编辑细胞中基因组的总体稳定性。例如，在不同的实验条件下产生的不同种类的应力可以诱导sgrna非依赖的异常，如Cas9-sgRNA复合物的转导。当CRISPR/Cas系统应用于临床和生物医学应用时，脱靶是一个主要的问题。

图1. CRISPR/Cas9系统的脱靶效应

3、CRISPR/Cas系统脱靶效应的检测方法及应对策略有哪些？

目前，已开发了多种用于检测和量化由CRISPR/Cas9和其他CRISPR/Cas系统引起的脱靶效应的方法，其中包括Whole-genome sequencing (WGS)、Genome-wide, GUIDE-seq、Digenome-seq、BLESS、EndoV-seq等。（表1-2）我公司经过多年不懈努力，开发了一种新型的高通量的脱靶检测方法AID-seq（IF=17分！重磅发布：珠海舒桐团队开发超灵敏特异的脱靶检测方法AID-seq发表于Cell旗舰子刊Med），与现有的脱靶检测方法相比，其敏感性和特异性均更胜一筹。

此外，也开发了多种脱靶预测工具，主要包括CRISPR-PLANT v2、CT-Finder(CRISPR Target、Cas-OFFinder) 等（表3）。

为了克服脱靶问题，现越来越多的新型编辑系统（单碱基编辑系统、Cas9系列变体、截短的sgRNA、RNA编辑系统等），高质量的参考基因组信息，更加合理、高效的sgRNA设计工具，高效的GE递送系统等得以开发，能够使基因组编辑体系越来越精确，高效和可靠，避免或减少脱靶效应。

表1：脱靶效应检测方法

表2：脱靶效应检测算法

表3：sgRNA设计工具

珠海舒桐医疗科技有限公司深耕基因编辑技术10余年，搭建了一站式基因编辑平台，为客户提供全面精确的基因编辑安全性检测和分析服务。我们的检测方法分为软件预测、体内脱靶检测、体外脱靶检测三类，其中体内脱靶检测有GUIDE-SEQ、PEM-SEQ等，体外脱靶检测有自主研发的AID-SEQ技术，可根据不同需求选择不同的检测方法。如有需求，欢迎咨询!

AID-seq 性能优势

AID-seq的灵敏度和特异性均优于现有的脱靶检测方法

我们使用PR曲线和ROC曲线来可视化不同脱靶检测方法的灵敏度和特异性。如下图所示，与SITE-seq、CIRCLE-seq和CHANGE-seq相比，AID-seq在三个测试中的AUPRC和AUROC得分最高。说明AID-seq无论是在敏感性还是在特异性上，都略胜一筹。

参考链接：https://mp.weixin.qq.com/s/I82IOAkRl5PEFbNhp3dZSQ

关于舒桐

珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，总部位于粤澳深度合作区——横琴新区，下设鼓润（武汉）医疗科技有限公司、广州舒桐医疗科技有限公司和杭州舒桐生物科技有限公司等全资子公司。公司为国家高新技术企业，拥有博士后工作站和多个博士后团队，已申请专利40余项，承担多项国家科技重大专项。公司致力于通过创新技术为多种疾病尤其肿瘤开展新药研发，提供基因靶向治疗方案。同时公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案；具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐医疗坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。