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文献解读 | 硬核Cas定向进化技术之Cas蛋白小型化

舒桐科技

2024-01-02

导读：舒桐科技搭建了一站式基因编辑平台，可提供从新型CRISPR工具开发、sgRNA设计筛选、载体递送、基因编辑有效性、安全性评估全流程解决方案。

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不同来源的Cas蛋白在氨基酸长度，编辑效率等方面均存在差异。作为CRISPR-Cas编辑系统的核心组分之一，Cas蛋白决定了基因编辑的效率和应用范围。以目前常用的SpCas9为例，其蛋白的长度接近1400个氨基酸，而常见的载体，如腺相关病毒（AAV）通常只能容纳4-4.7kb的基因片段，不足以同时容纳sgRNA和SpCas9蛋白。在基因编辑的实际应用过程中，人们经常会发出这样的感叹：Cas9蛋白之大，一个载体塞不下。如果我们能对我们常用的Cas9进行改造，使其体积更小，那该有多好啊。

今天，舒桐科技小编为大家介绍一个Cas小型化的硬核技术。该方法基于AlphaFold2的蛋白结果预测结果，通过与同源的Cas蛋白进行比较，将非必要氨基酸序列去除，达到Cas蛋白小型化的目的。该方法以“A strategy for Cas13 miniaturization based on the structure and AlphaFold”为题目发表在Nature Communications杂志上。.

该方法的核心步骤是：

1）比较同一家族Cas蛋白的蛋白结构，以是否与sgRNA互作为依据，去掉出对Cas蛋白功能非必要的氨基酸序列，得到不同的突变体。

2）利用AlphaFold2预测各个突变体的蛋白结构，并与野生型Cas蛋白的结构进行比较，选出与野生型结构一致的突变体。

3）实验验证突变体的切割效率。

该文章的作者以RfxCas13d蛋白为例，以EsCas13d为同家族的模板，分析得到了8个非必要的区域（图1）。

图1. RfxCas13d的蛋白结构解析

将这些非必要氨基酸去除，设计不同的突变体（图2），幸运的是，每一种突变体都保留了和野生型一致的切割效率。

图2. RfxCas13d的小型化突变体

最终，作者将8个突变位点集中在一个突变体中，得到了一个约600个氨基酸的mini-RfxCas13d蛋白，通过实验验证，mini-RfxCas13d蛋白的切割效率和蛋白结构均与野生型的RfxCas13d蛋白保持高度一致（图3）。

图3. Mini-RfxCas13d与野生型RfxCas13d蛋白在功能和结构上保持一致

同时，作者用同样的方法对Cas13b家族进行小型化改造，均得到了和野生型高度一致的小型化蛋白（图4）。这文章证明了基于AlphaFold2结构预测的蛋白改造方法，具有良好的通用性和应用前景。

图4. PspCas13b蛋白在的小型化改造

舒桐科技长期致力于基因编辑领域，搭建了一站式基因编辑平台，可提供从新型CRISPR工具开发、sgRNA设计筛选、载体递送、基因编辑有效性、安全性评估全流程解决方案。其中，舒桐自研高保真CRISPR-FrCas9获国际专利授权，本项专利CRISPR-FrCas9切割效率强、脱靶效应低、特异性好、PAM限制少，显著优于SpCas9。如有需求，欢迎垂询。

关于舒桐

珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，总部位于粤澳深度合作区——横琴新区，下设鼓润（武汉）医疗科技有限公司、广州舒桐医疗科技有限公司和杭州舒桐生物科技有限公司等全资子公司。公司为国家高新技术企业，拥有博士后工作站和多个博士后团队，已申请专利40余项，承担多项国家科技重大专项。公司致力于通过创新技术为多种疾病尤其肿瘤开展新药研发，提供基因靶向治疗方案。同时公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案；具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐医疗坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。