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拟杆菌（Bacteroides）是人类肠道微生物中最为丰富的菌群，在健康肠道的发育和维持中起着十分重要的作用。其与多种疾病相关，如肥胖、炎症性肠病和结肠癌等，被越来越多用于研究肠道共生微生物的生理和功能的模式生物。但现阶段对于拟杆菌的研究比较少，现有的几种方法的基因编辑效率和普适性较低。
CRISPR/Cas系统已被用于多种生物体的基因编辑，且有关文献报道，CRISPR/Cas系统被成功用于多形拟杆菌的靶向敲低。基于此类方法，开发了能高效且广泛用于拟杆菌属的基因编辑方法。下面小编为大家进行详细介绍，同时也对实验可能出现的问题提出一些自己的解释。
本文主要包括以下几个内容：
1. CRISPR/Cas系统基因编辑的实验流程
2. 一体化 CRISPR/Cas系统
2.1 三种Cas蛋白一体化质粒的构建
2.2 三种一体化质粒的在多形拟杆菌中的编辑效果
3. CRISPR/Cas12系统编辑效果
3.1 不同长度基因敲除的效率
3.2 基因插入效率
4. CRISPR/Cas12在不同拟杆菌中编辑效率
4.1 Cas12蛋白的诱导表达的效率
4.2 Cas12蛋白在四种拟杆菌中的编辑效果
CRISPR/Cas系统基因编辑的实验流程
文章中构建了一个拟杆菌和大肠杆菌的穿梭质粒，这种一体化的质粒编码一个Cas蛋白、一个或两个sgRNA、一个同源修复模块和可用于在两种菌株中复制和结合的相关元件，随后将质粒转入到大肠杆菌S17中。通过细菌接合的方式将一体化质粒转入拟杆菌中，进行基因编辑，利用PCR和测序验证获得阳性菌株后，利用无抗传代培养消除抗性质粒（以100稀释传代5-10次），得到最终的缺陷性菌株。
一体化 CRISPR/Cas系统
一体化质粒系统包含一个Cas蛋白，一个或两个sgRNA，一个同源修复模块，一个启动子和其他相关元件。文章中验证了三种Cas蛋白（FnCas12、SpRY、SpCas9）对多形拟杆菌中果糖基碳水化合物基因的编辑效率，结果显示当Cas蛋白表达由可诱导的P1TDPGH023启动子控制时，通过aTC（无水四环素）诱导后，三种Cas蛋白的编辑效率分别接近60%、40%和40%，远远高于其他启动子（Pbt1311和没有aTC诱导的P1TDPGH023）编辑效率，这就表明P1TDPGH023启动子在多形拟杆菌中严格受aTC调控。三种Cas蛋白中FnCas12a的编辑效率最高，对于这点笔者自己的见解是不同的细菌对于表达蛋白的活性和稳定性不一样导致的结果；同时也可能是Cas9蛋白的毒性较大，导致编辑效率较低。与野生型相比，缺陷突变株在以果糖为唯一碳源的培养基中生长时生长速率呈现明显的降低。
CRISPR/Cas12系统编辑不同片段的编辑效果
CRISPR/Cas12在不同拟杆菌中编辑效率
为了能确定CRISPR/FnCas12a系统是否可以应用于不同的人类肠道共生拟杆菌中，文章中构建了一套一体化质粒系统，分别应用于脆弱拟杆菌、卵形拟杆菌、普通拟杆菌和均匀拟杆菌。首先，文章中评估了P1TDPGH023启动子在aTC诱导条件下，相关基因的表达情况。然后选取四种拟杆菌的果糖基因（普通拟杆菌基因为阿拉伯糖基因）作为靶向基因进行基因缺失，每种菌株设计两条不同sgRNA进行基因编辑，结果显示可诱导的CRISPR/FnCas12a系统对四种不同的拟杆菌都具有编辑效率，且编辑效率在60%左右，其中普通拟杆菌的编辑效率为100%。之后，缺陷株在对应的培养基中生长，在其生长效率与野生型相比均有所下降。
文章中采用一体化质粒系统，可能导致质粒结构较大。在细菌转化和结合的难度可能会提升，在这方面笔者提供另一种思路采用双质粒系统（Cas蛋白质粒和sgRNA质粒），转化效率可能会有所提高。
珠海舒桐医疗科技有限公司长期致力于基因编辑领域，其中包括细菌的基因编辑，公司提供Rec同源重组和CRISPR/Cas系统两种细菌编辑方法。对于另外，珠海舒桐医疗是国内首家提供脱靶检测服务的公司，可提供GUIDE-seq体内脱靶检测、AID-seq体内脱靶检测等多种服务，欢迎垂询。
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